亲子鉴定中STR基因座的等位基因丢失分析与解决对策

何丽仪 车志文

亲子鉴定是通过对人类遗传标记的检测，根据遗传规律分析，对有争议的亲子关系进行亲缘关系鉴定。[1]随着科技的日新月异，亲子鉴定已经成为了我们日常生活中常见的活动，如办理出生证明、报户口、公正、诉讼、尸源认定等，都与亲子鉴定有联系。《中华人民共和国民法典》的颁布并于2021年1月1日起施行，直接规范了此类确认和否认亲子关系的诉讼，强化了父母与子女之间的权利与义务。通过司法鉴定明确是否存在亲子关系，已成为现实社会中许多解决涉及抚养、赡养和继承等诉讼案件的关键，因此一个客观、科学的鉴定结论十分重要。目前，国内外的亲子鉴定案例中，多数都采用STR基因座分型方法；但在此过程中偶尔会遇到个别基因座不相符合的情况，其原因有多种，等位基因丢失是其中之一。等位基因丢失的现象表现为在相应基因座上仅检测出1个等位基因，与纯合子的检测结果相似，但峰面积和峰高却与杂合子相当。[2]近年来，关于常染色体STR基因座的等位基因丢失现象常有文献报道，而且对多个基因座均有报道，可见此现象在日常的亲权鉴定中常有发生。本文拟分析两个案例，以探讨等位基因的丢失及其对亲权鉴定的影响。

一、案例资料

（一）案例资料与方法

1.案情摘要。

案例一：因入户需要，对疑父、孩子生母和孩子进行亲权鉴定。分别采集三人的指端末梢血涂于已灭菌的滤纸片上晾干保存、备检。

案例二：因办理出生医学证明需要，对疑父、孩子生母和孩子进行亲权鉴定。分别采集三人的指端末梢血涂于已灭菌的滤纸片上晾干保存、备检。

2.实验过程。

（1）DNA提取：分别剪取少量的上述血样于PE管中，用纯水洗脱血红素后加入浓度为5%的Chel⁃ex-100，经过56℃孵育，98℃变性，提取血样DNA备用。

（2）PCR扩增：

案例一采用ABI 9700扩增仪，STRtyper-21G和PowerPlex 21五色荧光标记复合扩增系统，10μl体系（8μ l扩增混合液+2μ lDNA模板）进行扩增。

案例二采用ABI 9700扩增仪，STRtyper-21G和PowerPlex 21五色荧光标记复合扩增系统用10μl体系（8μ l扩增混合液+2μ lDNA模板）进行扩增;Mi⁃croreaderTM21 Direct ID System和MicroreaderTM23sp ID System五色荧光标记复合扩增系统用10μl体系（9μ l扩增混合液+1μ lDNA模板）进行复测扩增。

（二）检测方法

STR基因座检测：分别将各个样本的1μl PCR扩增产物加入装有含内标的HiDiTM溶液（内标与HiDiTM溶液的比例为1:10）的96孔板上，并在3130XL型基因分析仪（美国ABI公司）上进行毛细管电泳，用GeneMapper ID v 3.2软件分析各基因座的基因型。

二、实验结果

（一）案例-结果分析在案例一采用STRtyp⁃er-21G试剂盒检测得到的基因分型结果中，除了D18S51基因座外，其余的19个基因座基因型均符合孟德尔遗传规律。在D18S51基因座中，疑父的基因座分型为15，15，孩子生母基因座分型为14，14，孩子的基因座分型为14，14（如图1）。经PowerPlex 21试剂盒复测疑父与孩子的血样，在D18S51基因座中，疑父的基因座分型为15，18，孩子的基因座分型为14，18（如图2）。

图1 案例一中的疑父、孩子生母和孩子STRtyper-21G试剂盒STR分型图

图2 案例一中的疑父和孩子PowerPlex21试剂盒STR分型图

（二）案例结果分析在案例二采用STRtyper-21G试剂盒检测得到的基因分型结果中，除了D2S1338基因座外，其余的19个基因座基因型均符合孟德尔遗传规律。在D2S1338基因座中，疑父的基因座分型为19，19，孩子生母基因座分型为23，23，孩子的基因座分型为19，19（如图3）。经PowerPlex 21试剂盒、MicroreaderTM21 Direct ID System试剂盒和Micro⁃readerTM23sp ID System试剂盒复测三人的血样，疑父、孩子生母和孩子的D2S1338基因座分型结果依然与21G试剂盒检测的结果一致（如图4、5、6）。

图3 案例二中的疑父、孩子生母和孩子STRtyp⁃er-21G试剂盒STR分型图

图4 案例二中的疑父、孩子生母和孩子PowerPlex21试剂盒STR分型图

图5 案例二中的孩子生母、孩子和疑父MicroreaderTM 21 Direct ID System试剂盒STR分型图

图6 案例二中的孩子生母、孩子和疑父MicroreaderTM 23sp ID System试剂盒STR分型图

三、讨论

（一）等位基因丢失的判定

人类是二倍体，在每一个个体的一对等位基因中，一个来源于母亲，另一个来源于父亲，这个特定的等位基因对构成基因型，这是STR分型图谱所反映的重要信息。一般来说，单一个体的每个基因座或为纯合子，或为杂合子。纯合子的两个等位基因不能通过毛细管电泳所分离开来（它的两个等位基因具有相同的片段长度），所以电泳结果只出现单一的一个峰。在常染色体STR图谱分析中，良好的复合扩增体系各个基因座的片段峰信号强度应该比较接近。纯合子产物峰的峰高和峰面积比杂合子高，杂合子的两个等位基因峰高和峰面积接近。[3]当在亲子鉴定过程中出现单一基因座不符合孟德尔遗传规律时，首先观察STR图谱上该基因座的出峰情况：当该基因座上亲代与子代均检出2个等位基因，那么一般可以排除等位基因丢失的可能性，而该情况考虑为基因突变的可能性比较大；当该基因座上亲代与子代均检出1个等位基因时，比较该基因座与邻近基因座上的等位基因峰高与峰面积的大小。若该基因座上的片段峰峰高和峰面积与邻近基因座上的杂合子片段峰峰高和峰面积相当，且接近邻近基因座上的纯合子片段峰峰高和峰面积相的一半，那么一般考虑为等位基因丢失的可能性比较大。

观察案例一中疑父与孩子的STRtyper-21G试剂盒检测结果，在20个基因座中仅有D18S51基因座不符合孟德尔遗传规律。在D18S51基因座的等位基因中，疑父的基因型为15，15；孩子的基因型为14，14，考虑有基因突变和等位基因丢失的可能性。但在该基因座中，疑父和孩子均只检出1个片段峰，显示为纯合子状态，然而这两个峰的峰高与其各自相邻基因座的杂合子等位基因峰峰高相仿，是另一相邻的基因座的纯合子等位基因峰峰高的一半左右（详见图1），由此判断疑父与孩子在D18S51基因座中存在等位基因丢失的可能性较大。通过Power⁃Plex 21试剂盒复核检测，疑父与孩子在D18S51基因座中均为杂合子（疑父为15，18；孩子为14，18），等位基因的峰面积和峰高均衡（详见图2）。以此证明用STRtyper-21G试剂盒检测时，疑父与孩子在D18S51基因座中出现等位基因丢失的现象。

（二）等位基因丢失的原因

在DNA的STR重复区域内部和周围存在着序列多态性。当待检测的DNA模板在PCR引物结合区发生核苷酸变异（相对所设计使用的引物而言），导致引物无法与该区域的结合位点结合，DNA模板复制失败，因此一个等位基因漏检了（被漏检的等位基因又称无效等位基因）。[4]这是造成等位基因丢失的主要原因。为进一步了解案例一中疑父与孩子在D18S51基因座上等位基因18丢失的原因，在STRtyper-21G系统D18S51引物的外侧重新设计引物：正向CAATACGCAAACCGCCTCTC、反向 CGAC⁃TACCAGCAACAACACAA[5]，并对疑父和孩子的样本进行Sanger测序，结果如图7～8所示：

图7 案例一中疑父D18S51等位基因18测序结果

图8 案例一中孩子D18S51等位基因18测序结果

测序结果显示两样本在STRtyper-21G系统D18S51等位基因18的前引物结合区DNA序列（5’-TTCTTGAGCCCAGAAGGTTA-3’）与GenBank数据库参考序列和STRtyper-21G系统引物序列（5’-TTCTTGAGCCCAGAAGGTTA-3’）不一致，检索GenBank、Hapmap数据库此处及周围序列未发现SNP；上述样本测序结果显示参考序列引物结合区3’端第5个碱基为G缺失，说明样本在该处发生了点突变。

（三）等位基因丢失的解决对策

在目前广泛应用的多种试剂系统中，有些试剂系统所设计的引物序列特异性相对较低，这比较容易出现等位基因丢失的情况。为避免等位基因丢失而造成假排除，我们可以通过以下方法解决：

1.采用包含潜在无效等位基因的基因座的不同试剂系统进行复核检测。

等位基因丢失可以直接影响鉴定结果的判定，但通过采用不同的STR试剂盒检验时，这种现象还是比较容易被发现的。如案例一中采用STRtyp⁃er-21G试剂盒检验时，疑父和孩子在D18S51基因座中均出现了假纯合子，不符合遗传规律；经Power⁃Plex 21试剂盒复核检验时，疑父和孩子在D18S51基因座中均检测出杂合子，符合遗传规律，证实在该基因座出现了等位基因丢失的现象。

2.增加基因座检测，降低等位基因丢失对亲子鉴定的影响，增加证据的强度。

亲子关系的确认依赖于孩子与可疑父亲或母亲之间在所有检测的遗传标记上是否存在共有等位基因。[6]因此，亲权指数是判断肯定父权或母权的依据。在DNA的检验中，没有一对引物可以保证绝对不会出现等位基因丢失现象。当采用多种试剂盒进行检验时，亲代与子代在同一基因座中出现不符合遗传规律，而且只存在一个基因座不相符时，我们可以增加基因座检测，依据GB/T 37223-2018《亲权鉴定技术规范》中三联体不符合遗传规律计算方式来计算该基因座的亲权指数，并计算累计亲权指数来判定被检者之间的亲子关系。如案例二中，三位被检者的血样均采用了STRtyper-21G试剂盒、Power⁃Plex 21试剂盒和MicroreaderTM21 Direct ID System试剂盒进行检测，孩子生母和孩子在D2S1338基因座中均出现不符合遗传规律；增加MicroreaderTM23sp ID System试剂盒检验，孩子生母和孩子在该基因座中依然是出现纯合子的分型结果，不符合遗传规律；综合上述4个试剂盒的检验结果，除D2S1338基因座外，其余的38个基因座均符合遗传规律。在此情况下，可以将该基因座的不符合情况看作是基因突变（四步突变）来计算三联体的累计亲权指数作出判断，得出鉴定结论。[7]

此外，观察案例二中疑父，孩子生母与孩子的4种试剂盒检测结果，39个基因座中只有D2S1338基因座不符合孟德尔遗传规律；孩子生母与孩子在D2S1338基因座的等位基因中，两者均只有一个峰（孩子生母为23；孩子为19），并且这两个峰的峰高与其各自相邻的基因座的杂合子等位基因峰峰高相当，是相近的基因座的纯合子等位基因峰峰高的一半左右（详见图3～6）。根据上述，考虑该基因座出现不符的原因可能是等位基因丢失；此外还有突变的可能，如单亲二倍体。单亲二倍体（uniparental di⁃somy，UPD）是指在染色体核型中，某些同源染色体或染色体上的部分片段均来源于双亲中的一方，未检测到另一亲本来源的染色体或染色体的部分片段。[8]在2号常染色体中，基因座D2S1338和D2S441，前者基因型为孩子生母（23，23）、孩子（19，19）、疑父（19，19）如图3所示，后者基因型为孩子生母（11，11）、孩子（11，11）、疑父（10，11），如下图所示：

孩子生母

孩子

疑父

在D2S1338基因座上，孩子与生母表现为不符合孟德尔遗传规律，同时孩子与疑父的基因型一致。在D2S441基因座上孩子与生母、疑父均符合孟德尔遗传规律，但是在该基因座上孩子的等位基因11有可能只来源于疑父，即不能排除孩子为2号染色体表现为父源性UPD的可能性。在该案例中，孩子若出现了父源性UPD，这对于本次亲权鉴定是直接增加疑父的父权确信性。

综上两个案例表明，在亲子鉴定过程中遇到特殊情况作出合理的思考判断，并据此增加实验进行验证是很有必要的。亲子关系的问题涉及到现实社会民事活动中的方方面面，诸如家庭稳定、未成年人权益保护和社会伦理等等。关于父母与子女之间的关系，在我国现行法律所述中是指生物学上的父母与子女之间的亲子关系。当在诉讼过程中需要通过司法鉴定手段来判定父母与子女关系时，就是要对涉案的被鉴定人进行亲子关系鉴定，给出被鉴定父母与被鉴定子女之间是否存在生物学上的父母亲关系的鉴定意见。倘若是在鉴定过程中出现等位基因丢失而错判为该遗传标记不符合遗传规律时，即使根据初步数据进行亲权指数的计算结果判定鉴定意见为支持疑父或疑母是孩子的生物学父亲或母亲的，而该司法鉴定意见书是作为证据使用的，这样一个错误的判断会影响到该司法鉴定意见书的证据效力。

因此，亲子鉴定是一项与民生息息相关的司法鉴定，其过程要严谨、实事求是，鉴定结论要科学、准确。只有这样做才能保证我们公民的权利得以真正地行使，履行的义务得以真正地到位。