橡胶树杂交子代遗传特性及遗传多样性分析

李文秀,贺军军,张华林,翁俊亮,李进良,罗 萍

(1. 中国热带农业科学院湛江实验站/广东省旱作节水农业工程技术中心，广东 湛江 524091; 2. 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，广东 湛江 524091)

【研究意义】巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)为大戟科(Euphobiaceae)橡胶树属(Hevea)多年生乔木，染色体2n=2x=36，原产于亚马逊森林[1]，在我国主要分布于海南、云南和广东等省份。天然橡胶是主要的工业原料之一，广泛应用于医疗、交通和国防等方面，是无污染可再生的重要自然资源[2]。根据国际橡胶研究组织提出的意见，随着经济发展，全球对橡胶的需求将会持续增加[3]。橡胶树杂交育种是最常规的育种方法，也是选育优良橡胶树品种的一个基本策略[4]。在橡胶育种实践中，优良品种的选择一般须通过有性杂交。橡胶树杂交育种是指选择各种特异亲本进行杂交，在子代中选择优良单株，利用芽接扩繁优良无性系进行推广，是橡胶树优良品系创育的一个基本策略[5]。实践证明，通过杂交育种，育种家们选育出了一批优良品种，如热研7-33-97[6]、热垦525[7]、PR107[8]、RRIM600[9]、GT1和PB86[10]等品种。提前发现杂交子代的优劣能反映出亲本杂交的有效性，缩短育种进程，及时更正育种策略。目前，经有性杂交选育出的抗寒性强产量中等湛试327-13、湛试327-4等[11]优良品系，都来自同一对亲本，这反映出了亲本选配合理，能将部分优良性状传递给后代，缩短了品种选育的成本与时间。将传统表型方法与标记选择相结合，可以更准确地实现杂交后代的鉴定。形态鉴定虽然直接方便，但数量有限，易受环境影响。研究表明，具有相似形态的相似个体可能包含较大的遗传变异，这些变异可以通过分子标记来识别[12]。SSR分子标记具有多态性高、重复性好、操作简单等优点[13]，已被广泛应用于橡胶树种质资源的研究，如构建橡胶树遗传图谱[14]、种质多态性分析[13]、品种鉴定[15]、遗传多样性分析[16]。【前人研究进展】在其他作物上，表型特征和分子标记用于杂交后代杂种优势评价和遗传多样性分析已较为普遍。如Monica等[17]利用SRAP标记研究了花生殖细胞及其F1代的遗传变异及亲缘关系。Gao等[18]利用12个表型和11个SRAP标记对45个牡丹品种的遗传多样性进行了分析。此外，橡胶树表型多样性分析也有相关的研究报道[19]。【本研究切入点】由于橡胶亲本基因杂合度高，F1杂种往往存在较大差异。且到目前为止，橡胶树F1杂种的遗传特征和优劣特性研究依然比较有限。【拟解决的关键问题】本研究分别以PR107和93-114为父本和母本，通过剖析亲本以及杂交后代群体的重要性状和遗传关系，从而鉴定出杂交子代的变异程度及优劣情况，旨在为橡胶树杂交育种和亲本选配提供参考意义。

1 材料与方法

1.1 材料来源

供样材料来自中国热带农业科学院湛江实验站收集保存的93-114(母本)和PR107(父本)35份杂交后代群体资源，叶片形态如图1所示，于2016年建立亲本和后代群体的初级系比试验区，试验区分为3个小区，每小区按照株行距为3 m×3 m随机种植亲本和后代群体，每份资源相邻种植3株，共3次重复。

图1 杂交子代叶片形态

SSR标记：104对SSR引物，24对来自Souza[20]，4对来自Saha[21]，5对来自谢黎黎[22]，71对来自Gouva[23]，由上海生工生物技术有限公司合成，每对引物都进行重复扩增。

1.2 试验方法

1.2.1 表型性状的调查 型性状主要调查橡胶树茎干、产量和叶片等相关性状，包括26个描述性状和6个测量性状。按照黄华孙编写的《橡胶树种质资源描述规范和数据标准》[24]对26个描述性状进行调查，具体调查性状和分级标准见表1。大叶柄长度，小叶柄长度，小叶枕膨大长度，主测脉角度4个性状利用直尺和角度尺进行测量，每份资源测量3株，每株取5个重复。树围从2017年开始进行测量，每年12月用卷尺测量距离地面1 m处周长，用厘米进行表示。割胶参考Souza[25]的方法，在2020年9月和12月，使用S/2 d/3方法，在离地面50 cm的地方进行开割，每次割5刀，收集乳胶进行烘干称重，以克进行计量，每株产量计算方法以1刀进行计算，取3个小区的平均值得出。

表1 橡胶树F1性状描述分级

续表1 Continued table 1

1.2.2 基因组DNA提取 参考Murray等[26]的方法对橡胶树基因组叶片DNA进行提取。用1%琼脂糖凝胶电泳检测纯度与浓度，原液保存于-20 ℃备用。

1.2.3 引物筛选 用4份(PR107，93-114，A4和A8)表型差异较大的材料对合成的104对引物进行筛选，选出扩增效果好、条带清晰稳定的多态性引物15对，引物序列如表2所示。

表2 橡胶树SSR引物名称及序列

1.2.4 SSR-PCR体系 PCR扩增反应在TAKARA TP-600 PCR仪上进行。采用10 μL反应体系，反应体系包含DNA模板1 μL，ddH2O 4 μL，4 μL mix，上游引物和下游引物各0.5 μL。反应条件参考Liu等[27]的做法：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，复性30 s(温度以引物最适退火温度而定)，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸7 min。

1.2.5 PAGE凝胶电泳及检测 采用6%聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行电泳，电压180 V，电流80 A，时间60～90 min。银染方法参考Creste等[28]的方法。

1.2.6 数据分析 在Excel 2016中计算各性状的变异系数和多样性系数[29]；在Excel中计算每份材料年平均生长量，并使用ORIGIN v7.0绘制图表。采用SPSS 21.0软件计算最大值、最小值、平均值、标准差。计算中亲值和杂种优势如下公式所示：

MPs= (P1+P2)/2

对扩增稳定清晰的条带采用“0-1”记录其位置，在相同的迁移位置上的条带标记为“1”，无带标记为“0”，建立0、1的SSR标记矩阵图。

先用DataFormater软件[30]进行数据转换，利用 NTSYS-pc V2.10 软件按UPGMA方法进行聚类分析；利用PopGen3.2计算群体的观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观察杂合度(Ho)、Shannon’s信息指数(I)；使用Powermaker Version3.25软件计算PIC值和基因型数；利用MEGA(V7.0)和ITOL在线工具graphic (https://itol.embl.de/)进行遗传距离分析和绘制树状图。

2 结果与分析

2.1 表型性状的多样性分析

橡胶树93-114×PR107组合杂交子代F1群体主要表型性状的变异系数和遗传多样性指数见表3，32个表型性状的平均变异系数为32.59%，变异系数最大的表型性状是叶枕沟(60.90%)，最小的是小叶柄沟(0)。变异系数超过50%的有叶枕沟和大叶柄形状，说明这2个性状变异较丰富。而小叶柄沟(0)、小叶枕膨大(22.88%)、叶片质地(19.40%)、叶片颜色(18.14%)、三小叶间距(13.30%)、大叶柄长度(14.32%)和主侧脉角度(3.66%)变异系数均低于25%，表明以上性状遗传特性较稳定；其中小叶柄沟和主侧脉角度变异系数接近于0，说明这2个性状在杂交子代中基本没有差异。

表3 杂交后代F1群体的变异系数和遗传多样性指数

续表3 Continued table 3

32个表型性状多样性指数分布在3.22～3.53，平均值为3.46，表明杂交子代表型性状分布较为均匀。多样性指数受种数和均匀度的影响，在种数相同的情况下，Shannon指数越大，均匀性越好。其中，小叶柄沟(3.56)多样性指数最大，其分布较为均匀；而叶枕沟(3.26)的多样性指数最小，分布最不均匀。总体上，32个性状的多样性指数较大，且差异较小，表明表型性状在供试材料中分布较为均匀。

2.2 产量和树围杂种优势分析

杂交后代和亲本的树围和产量统计结果(表4)显示，杂交后代的平均树围较亲本有所增加，而平均产量较亲本有所减少。杂交后代的平均树围和年树围增长量均大于中亲值，杂种优势分别为101.2%和117.2%，杂种优势较强，这与小麦的杂种育种较为相似，杂交种杂种优势通常会高于中亲值[31]。而平均产量较中亲值却稍有下降，杂种优势为95.38%，处于中亲本优势。但值得注意的是，有40%杂交后代的产量高于双亲，说明在F1杂种中仍然可以选择高产单株。

表4 杂种优势

2.3 杂交后代树围和产量比较分析

在35个杂交后代中，产量最高的是材料A38，最低的是A9。从图2可以看出，12月份的产量数据中，材料A38、A22、A12和A25单株产量均在20 g以上，其中A38产量最高，单株产量超过25 g，产量最低的是A9。9月份的产量数据中，A29、A25、A24、A26、A38单株产量均超过5 g，其中A29单株产量最高，产量最低的也是A9。综合来看，A38的平均产量最高，A9的平均产量最低。

图2 杂交子代早期试割产量

从图3中可以看出，A22每年都是树围最大的材料，最大树围材料与最小树围材料的差异在逐年增大。2017—2020年4年期间，材料A22的树围最大(39.3 cm)，而A8、A23、A21和A23分别是每年树围最小的材料，极差分别为4.6、8.9、9.6和10.8 cm，可以看出，极差每年都在增大，最小树围材料每年都在轮换，说明个别材料前期生长慢，但后期生长会逐渐加快。此外，2017—2020年，杂交后代树围年生长量为5.6～10.4 cm，平均年生长量为6.7～8.8 cm(表5)，年均周长增量逐年降低，说明苗期生长速度快于后期。

表5 杂交子代树围的年生长量

图3 2017—2020年杂交子代树围生长

2.4 SSR标记多态性分析

利用表型差异较大的4个材料对104对引物进行扩增筛选了15对多态性引物，利用15对引物对亲本和杂交后代进行多态性检查，结果(表6)表明，每对引物位点的等位基因数为2～4个，平均为3个，有效等位基因数在1.4706～3.6953，所用引物位点Shannon’s指数、观测杂合度(Ho)、预期杂合度(He)和多态信息含量(PIC)分别在0.5004～1.3459、0.1714～1.0000、0.3246～0.7400和0.2710～0.6827，其中ACT59(0.2710)位点的多态性最低，ACT61(0.6827)位点的多态性最丰富。

表6 SSR标记多态性分析

2.5 SSR聚类分析

聚类分析结果(图4)表明，35个杂交后代可分为3类，遗传相似系数在0.54～0.89(结果未列出)，杂交产生的遗传变异较多，个体间遗传变异较明显。其中12个杂交后代 (A35、A1、A17、A16、A27、A20、A6、A31、A19、A2、A42和A40)和父本66 (PR107)分为第一组(I)；另外20个杂交后代(A4、A13、A9、A43、A36、A30、A29、A24、A38、A23、A28、A39、A33、A10、A25、A45、A21、A12、A37、A22)组成第二组(II)；母本45(93-114)和材料A8、A11和A32形成第三组(III)。此外，由于标记数量有限，在进化树中分辨率不够高，无法区分某些杂交后代，如材料A12和A22。

图4 杂交子代SSR聚类分析

3 讨 论

对于基因型高度杂合作物，获得新类型材料和选育有价值新品种的一个有效办法就是开展杂交育种[32]。开展杂交育种的前提是选择性状优良互补、遗传差异较大和一般配合力强的亲本，然后通过研究杂交后代的遗传和变异规律，了解性状组合情况及遗传倾向[33]，最终选出理想的品系或品种。

本研究对35份PR107和93-114组合F1杂交后代的32个主要表型性状的变异类型和形态多样性进行分析，杂交后代平均变异系数和遗传多样性指数分别为32.59%和3.46，具有丰富的形态多样性。这说明了杂交亲本基因型高度杂合，对于选出具有杂种优势的材料具有重要的意义。叶枕沟(60.90%)和大叶柄形状(50.75%)2个性状变异较大，结果与张晓飞等[34]对119份橡胶树栽培种的21个农艺性状进行比较分析的结果较为类似；与之不同的是遗传多样性指数平均值，张晓飞得出的结果是0.83，而本研究是3.46，其中的差异有待后续研究。另外，在本研究中，变异系数很低的情况下遗传多样性系数一样也很高。变异系数和多样性指数都是反映材料多样性的重要指标，变异系数反映的是变异类型的离散程度，遗传多样性系数反映的是性状分组数目和组内性状分布的均匀程度[35]，两者不存在相关关系。

利用该组合和杂交后代群体有可能筛选出高产子代和速生子代。树围和年增量的杂种优势指数均大于100%，但产量杂种优势小于100%，表明在树围和产量上均存在杂种优势，但产量在该杂交后代群体中稍弱。比较2020年9月和12月的产量结果，可以发现产量曲线趋势基本一致，说明产量结果可靠，可重复性好。唯一的偏差是材料A12，其结果的准确性有待日后再次验证。

产量和树围综合分析结果表明，材料A38和A22在杂交后代综合表现较好。通过比较树围和产量数据，杂交后代中，A22、A43和A38的树围较好，树围生长显著快于亲本；A38、A22和A25是杂交后代中产量最高的3个材料。因此，综合来看，材料A38和A22是较好的种质。

通过对杂交后代的遗传多样性分析，了解亲本选配和杂交后代遗传背景情况，对育种工作具有重要的指导意义。PR107是初生代无性系[5]，具有的优良特征描述，以PR107为亲本，先后选育出的品种有热研7-33-97、云研77、大丰95等[36]；品种93-114是华南热带作物科学研究院粤西试验站于1967年从无性系天任31-45和合口3-11杂交子代中选育的次生代无性系，抗寒力强，抗风能力好[37]。本研究应用分子标记对35份PR107和93-114杂交后代进行了遗传多样性分析，杂交后代中大多数位点与父本PR107的基因型位点相似，说明PR107和93-114组合杂交F1代更偏向于父本遗传。遗传多样性分析结果可将杂交后代分为3类，材料类型较为丰富，反映出杂交亲本的选配合理。本研究从表型性状和分子标记两个方面分析了亲本和杂交子代群体的遗传特性和遗传分化，为亲本组合的甄选和杂交后代的差异分析等工作提供参考依据。

4 结 论

93-114×PR107杂种F1表型性状的变异系数和多样性指数分别为32.59%和3.49%。杂种优势分析表明，杂种一代的树围杂交优势比产量强。综合产量和周长分析结果表明，A38和A22在杂交种中表现较好。利用UPGMA对杂交种进行聚类分析，结果表明，杂交种可分为3个类群。