基于转录组的荔枝泛素结合酶基因家族的鉴定及表达分析

董晨　李金枝　郑雪文　王弋　李伟才

摘  要：泛素結合酶在泛素化级联反应中居于中心位置，是连接泛素活化酶和泛素连接酶的桥梁，在泛素化系统中发挥着关键作用。本研究基于荔枝转录组数据库，利用生物信息学方法对转录组数据库泛素结合酶UBC基因家族进行鉴定，最终得到28个LcUBC基因家族成员。通过荧光定量PCR技术对LcUBC基因家族在‘妃子笑’荔枝不同组织中进行时空表达分析，并对花穗对照和烯效唑处理花穗发育的不同时期进行表达分析。结果表明：LcUBC基因家族成员对应所编码的氨基酸数分布在85～1146 aa之间，等电点大小在4.03～9.61之间，5个LcUBC蛋白为稳定蛋白，其余均为不稳定蛋白。2个LcUBC蛋白定位于细胞质，2个LcUBC蛋白定位于细胞质和细胞核，1个LcUBC蛋白定位于内质网，其余蛋白均定位于细胞核。系统进化分析结果表明，LcUBC蛋白分为10个亚家族;28个LcUBC基因家族成员在不同组织的表达量存在差异;烯效唑处理‘妃子笑’荔枝花穗与对照相比，烯效唑处理21 d后，LcUBC基因家族成员的多个基因表达量较高。这是在转录组水平分析LcUBC基因家族成员，本研究结果对今后该基因家族的分类、克隆和功能研究提供了参考依据。

关键词：荔枝;泛素结合酶;基因家族;表达分析中图分类号：S667.1      文献标识码：A

 

Ubiquitin-conjugating enzymes play a central role in the ubiquitination cascade. They are the bridge between ubiquitin activating enzymes and ubiquitin ligases， and play a key role in the ubiquitination system. Through the local BLAST search and keyword search of transcriptome database， 32 ubiquitin-conjugating enzyme gene family members， including 5  and 28  genes， were obtained through smart screening of conserved domains. Only –  was studied in the article. Based on the litchi transcriptome database， the ubiquitin-conjugating enzyme gene family was identified by bioinformatics methods， and the temporal and spatial expression of ubiquitin-conjugating enzyme gene family in different tissues and organs of Feizixiao litchi was analyzed by the fluorescence quantitative PCR technology. Meanwhile， the expression of the control and uniconazole treatment at different stages of flower development was analyzed. The results showed that the amino acids were 85–1146 aa. The isoelectric point ranged from 4.03 to 9.61. Five LcUBC proteins were stable， and the others LcUBC proteins were unstable. Two LcUBC proteins were located in cytoplasm， two LcUBC proteins in cytoplasm and nucleus， one LcUBC protein in endoplasmic reticulum and the rest LcUBC proteins in nucleus. There were great differences in the length of the protein and the changes in the characteristics of the protein， indicating that the proteins of the ubiquitin protease gene family had different characteristics. In the multiple sequence alignment， all 28 LcUBC genes contained an evolutionarily highly conserved amino acid residue cysteine active site， and the C-terminal tryptophan （W） located behind the cysteine active site. The 28 LcUBC proteins were also highly conserved， and the “HPNI” conserved motif was located 7–10 amino acids before the active site of cysteine. The LcUBC gene family was predicted to contain 10 conserved motifs. There were certain differences in the number and types of conserved motifs contained in the members of the LcUBC gene family. Among them， the conserved motifs 1 and 2 were very important conserved motifs in the LcUBC domain. Phylogenetic analysis showed that the litchi UBC protein was divided into 10 subfamilies， namely UBC1， UBC2/11， UBC3/7， UBC4/5， UBC6， UBC8， UBC10/12， UBC13， UBC14， UBC15. The 28 genes were expressed in at least one tissue， and the expression levels of different genes in different tissues were different. Among them， the expression of ，， and  in seeds were significantly higher than that of other tissues， and the expression of7 in male flowers was significantly higher than that of other tissues. The expression level of female flowers of  and  was significantly higher than that of other tissues， and  was highly expressed in pericarp and old leaves. Compared with the control， the expression levels of LcUBC genes in different developmental stages of Feizixiao litchi flower spikes treated with uniconazole were higher at 21 days after the treatment with Uniconazole. This is the first time that the litchi UBC gene family was analyzed at the transcriptome level. The results of the study would provide some referrences for future studies on the classification， cloning and function of this gene family.

 Sonn.; ubiquitin-conjugating enzyme; genes family; expression analysis

： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.05.002

荔枝（Sonn.）是热带、亚热带发展中国家的最重要的作物之一。目前荔枝产业已成为中国华南热作产业的支柱产业之一，对中国南方农村经济的发展和热区农民收入水平的提高发挥了举足轻重的作用。2018年是我国有史以来最丰产的一年，据不完全统计，全国荔枝种植面积约为54.2万hm，产量约为301万t，种植面积排在苹果、柑橘、梨、葡萄和桃之后，属于大宗果树，但从总产量来看却还算“小水果”。2018年荔枝结果面积按照总种植面积的80%计算，平均单产不足7.0 t/hm。‘妃子笑’具有花穗长、花量大、坐果率低的特点，坐果率低是其生产中亟待解决的一个“瓶颈”问题，调控坐果的分子机理是当今果实发育领域研究的一个热点问题。

泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）广泛存在于真核生物中，并且在维持细胞功能、细胞周期运转、抵御环境胁迫、胚胎发育、激素响应和衰老等方面发挥着重要的作用。在泛素化过程中，关键酶主要包括泛素活化酶（E1）、泛素结合酶（E2）和泛素-蛋白连接酶（E3）。编码E2及E2-like的基因已报道37个，根据结构和序列的相似性可分为12个亚家族或14个组，E2-like基因8个。E2蛋白的典型特征是包含一个长约140～200 aa的保守催化结构域——UBC结构域，内含有1个高度保守的半胱氨酸活性位点，另外还存在一类UEV（ubiqutin E2 variants）蛋白，该蛋白家族在序列和结构上与泛素结合酶相似，但是缺少半胱氨酸催化位点，其功能也与典型的泛素结合酶蛋白有所不同。E2多以基因家族的形式存在，参与许多植物生理活动。泛素结合酶在泛素化级联反应中居于中心位置，是连接泛素活化酶和泛素连接酶的桥梁，在泛素化系统中发挥关键的作用。

目前，对E2基因的研究多集中在对DNA的修复进程。如在核酸修复途径中，UBC35/UBC36和 Mms2p/Uev1a蛋白形成复合物，在赖氨酸位点催化形成泛素链，来引发核酸修复的信号转导，完成对受损核酸的修复。UBC13协同E3连接酶RNF 8相互作用形成复合物，DNA损伤信号通过依赖泛素化的信号途径来传递至染色质，引发染色质蛋白的磷酸化，促使RNF 8-UBC 13复合物定位到受损伤的核酸部位，产生泛素链后触发DNA修复信号通路，使RAP 80蛋白和整個Brca1A复合物定位到受损伤的DNA部位，对损伤的DNA进行修复。另外还有研究表明RNF 8-UBC 13复合物可独立的行使底物蛋白的泛素化，并促进DNA损伤的调节子53BP1蛋白的积累。

泛素结合酶在植物衰老和果实发育过程中起重要作用。PICTON等首次从番茄中克隆到泛素结合酶基因，研究发现泛素结合酶基因在番茄叶片衰老和果实成熟过程中表达。香蕉采后早期抑制差减文库中筛选得到香蕉中的泛素结合酶基因，该基因介导细胞内小的调节蛋白的降解，与酵母中的UBC 4/UBC 5结合，推测该基因可能通过影响果实成熟过程中淀粉酶的活性或含量而参与对淀粉降解的调控，在果实成熟衰老的分解代谢中发挥作用。2013年日本学者研究表明，大豆近等基因系成熟基因座等位基因对基因型的修饰可以提供新品种，与对照相比，新品种花期较晚且产量高，可以适应不同的纬度环境，并可保留原来的种子质量。WANG等研究发现，番茄中2个E2基因（和）参与调控番茄果实成熟，但具体分子调控机制尚不清楚。DONG等研究香蕉花后果实不同发育阶段E2基因家族的表达情况，结果发现E2基因家族不同成员在果实发育不同阶段行使功能，推测这些基因在果实发育过程中发挥关键作用。陈曙等研究低磷处理下玉米幼苗不同组织中基因的表达情况，结果发现基因具有组织表达特异性，在叶片中大量表达，推测基因是通过调控玉米对磷元素吸收和转运间接影响光合作用效率。

通过对拟南芥基因组数据库搜索显示，基因以多拷贝形式存在，造成E2蛋白功能冗余，这可能是使基因的研究进展不大的主要原因。近年来，随着基因组测序技术的不断提高，越来越多的植物完成全基因组的测序工作，越来越多的植物物种中泛素结合酶基因家族在基因组学上得到鉴定，如玉米、可可、水稻、葡萄、普通油茶和香蕉等。目前，关于荔枝基因家族的研究有XTH、ARF基因家族，关于荔枝泛素结合酶基因家族仅仅研究了基因。

本研究基于荔枝转录组数据库，利用生物信息学方法对转录组数据库UBC基因家族进行鉴定，并通过荧光定量PCR（qPCR）技术对LcUBC基因家族在‘妃子笑’荔枝不同组织中进行时空表达分析，并对花穗对照和烯效唑处理花穗发育的不同时期进行表达分析，挖掘关键的LcUBC基因家族成员，为今后LcUBC基因功能的研究奠定基础。本研究结果将为从蛋白质降解方面深化荔枝坐果机理的研究和生产上调控荔枝坐果技术措施提供理论依据。

材料与方法

 材料

供试品种为‘妃子笑’荔枝，取自广东省湛江市麻章区湖光镇湖秀路一号南亚热带作物研究所荔枝栽培示范园，荔枝UBC蛋白序列来源于本课题组前期构建的‘妃子笑’花穗发育转录组数据库（GenBank accession SRP092890）。

 方法

1.2.1  LcUBC基因家族的鉴定与分析  利用模式植物拟南芥和水稻UBC序列作为探针序列，运用本地Blast软件对荔枝测序转录组数据库中的unigene进行搜索;同时，利用关键词“Ubiquitin- conjugating enzymes”和“UBC”直接检索，得到所有可能的UBC序列后，对检索结果进行整合分析，去除重复序列后，利用Pfam在线软件对序列保守结构域进行鉴定，去除不含LcUBC基因家族保守结构域的序列。

1.2.2  LcUBC蛋白的基本理化性质、序列比对和进化分析  运用ProtParam在线软件（http：//web. expasy.org/protparam/）分析預测LcUBC蛋白序列的分子量、等电点、不稳定系数、脂肪指数和疏水性等基本的理化性质;采用Plant-mPLoc Server在线软件（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/ plant-multi/#）分析LcUBC蛋白的亚细胞定位;运用MEME 4.12.0在线软件（http：//meme.nbcr.net/ meme/）分析LcUBC家族蛋白的保守基序，参数设置：基序的最大数目设置为10， 基序长度设为6～150个氨基酸，其他参数为默认值。通过MEGA 6.0的MUSCLE程序比对氨基酸多重序列，参数为程序默认参数。利用多重序列比对产生的LcUBC保守结构域145个氨基酸残基后续进行NJ（Neighbor-Joining）分析。采用MEGA 6.0软件构建进化树，Bootstrap值设为1000次重复，以获得更为可靠的分支聚类，其他参数为默认参数。

1.2.3  LcUBC基因家族在花穗调控下的表达特征分析  选择树龄相同、长势相近的‘妃子笑’荔枝树，分别选取荔枝树的不同组织如嫩叶、根、茎、老叶、雌花、雄花、果肉、果皮、种子，液氮速冻后存放于–80℃冰箱中，用于RNA的提取。

花穗处理：选择树龄相同、长势相近的‘妃子笑’荔枝树，当花穗长度抽生至约18 cm时，进行如下操作：（1）对照组（CK），不做任何处理;（2）烯效唑（Un）处理，用50 mg/L烯效唑（品牌：四川国光，有效成分含量5%）喷施，喷至叶面滴水;分别取对照及烯效唑处理后0、7、14、21、28、35、42 d的花穗，液氮速冻后存放于–80℃冰箱中，用于RNA的提取。

选用前期课题组筛选的为内参，根据转录组中注释的LcUBC的核苷酸序列，利用在线软件Primer 3 plus设计荧光定量引物（表1），通过Blast分析引物的特异性，引物序列委托广州艾基生物技术有限公司合成。将处理好的材料按照RNA提取标准进行磨样，采用华越洋生物科技有限公司RAN提取试剂盒QK型，分别对根、茎、嫩叶、老叶、雌花、雄花、果肉、果皮、种子和花穗的总RNA进行提取，提取1 μL检测RNA的质量和浓度，样品符合要求后利用M-MLV逆转录酶（TaKaRa）反转录合成cDNA。qPCR分析采用SYBR Premix Ex Taq™（TaKaRa）试剂盒，Roche480Ⅱ定量PCR系统（瑞士），采用384孔板，qPCR反应体系为10 μL，其中cDNA 1 μL（相当于25 ng总RNA），10 µmol/L基因特异性引物1 µL，2×SYBR Premix ExTaq 5 μL，最后用ddHO补足10 μL。qPCR反应条件：50℃预变性2 min，95℃预变性2 min;95℃变性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸30 s，共55个循环。每个样品3个重复。采用2法计算基因相对表达量。

结果与分析

 基因家族的鉴定

首先对转录组数据库的本地Blast进行比对检索和关键词搜素，再通过SMART对保守结构

域进行筛选，最终得到28条LcUBC蛋白序列。为了便于研究，按照转录组中的基因ID大小前后顺序统一为LcUBC蛋白编号为LcUBC 1～LcUBC 28（表2），对应所编码的氨基酸数分布在85～ 1149 aa之间;预测的理论分子量大小范围在9.668～102.307 kDa之间。等电点大小范围在4.03～9.61之间，其中 18个LcUBC蛋白的等电点小于7，显酸性;10个LcUBC蛋白等电点大于7，显碱性;LcUBC蛋白平均等电点小于7，表明UBC蛋白为弱酸性，在酸性的亚细胞环境中发挥作用。不稳定指数分析结果发现，5个LcUBC蛋白（LcUBC 4、LcUBC 9、LcUBC 18、LcUBC 23和LcUBC 25）的不稳定指数小于40，为稳定蛋白，其余均为不稳定蛋白。平均亲水系数结果表明，除了LcUBC 4蛋白疏水，其余均为亲水蛋白。亚细胞定位分析结果表明，LcUBC 7和LcUBC 16蛋白定位于细胞质，LcUBC 1和LcUBC 24蛋白定位于细胞质和细胞核，LcUBC 6蛋白定位于内质网，其余蛋白均定位于细胞核。综合上述分析结果，无论从氨基酸序列的长度还是蛋白的特性变化分析，LcUBC蛋白都有很大差异，这表明LcUBC基因家族蛋白具有不同特性。

 基因家族蛋白保守基序分析

通过多重序列比对LcUBC基因家族的氨基酸序列全长，比较不同LcUBC家族成员间UBC保守结构域的特点（图1），多重序列比对中，28个基因均含有进化上高度保守的氨基酸残基半胱氨酸的活性位点，位于半胱氨酸活性位点后的C-端色氨酸（W）在28个LcUBC蛋白中也高度保守，“HPNI”保守基序位于半胱氨酸活性位点之前的7～10位氨基酸。

通过在线软件MEME分析LcUBC蛋白中的保守基序，结果见图2。预测LcUBC基因家族中含有10个保守基序，LcUBC基因家族成员之间所包含的保守基序数目及种类存在一定的差异。在LcUBC基因家族中有25个成员含Motif 1基序，有15个成员含Motif 2基序。通过SMART分析Motif 1、Motif 2为LcUBC蛋白结构域中非常重要的保守基序。

为进一步了解LcUBC基因家族成员之间的进化关系，利用模式物种拟南芥中的37个AtUBC和酵母中的13个ScUBC同荔枝中的28个LcUBC构建系统进化树（图3），结果表明，荔枝中的28个LcUBC分为10个亚家族，分别为UBC1、UBC2/11、UBC3/7、UBC4/5、UBC6、UBC8、UBC10/12、UBC13、UBC14、UBC15，其中UBC14和UBC15在酵母基因组中缺失，推测UBC14和UBC15是植物中特有的或是酵母进化过程中丢失。

  基因家族时空表达分析

UBC参与DNA的损失修复、生长、发育及胁迫响应等方面，为了研究LcUBC基因家族在不同发育过程中的功能，分析9个不同组织（如嫩叶、嫩茎、果皮、种子、根、雄花、老叶、雌花、果肉）中基因的表达情况（图4）。在植物正常的发育过程中，不是所有的基因在不同组织部位都表达，28个LcUBC基因家族成员中至少在某一个组织部位表达（图5），推测这些基因有可能是在生物胁迫或非生物胁迫条件下表达。其中，在种子中的表达显著高于其他组织，在雄花中的表达上显著较高于其他组织，在雌花中的表达量显著高于其他组织，在果皮和老叶中高表达。

  基因家族在花穗调控表达模式

利用qPCR分析LcUBC基因家族在荔枝花穗调控的表达量（图5），结果表明，与对照相比，LcUBC基因家族在烯效唑处理后表达量存在显著变化，经烯效唑处理后，在7、14、21、28、35 d表达量上调，在21 d表达量最高，在35 d表达量最高，表达呈现先上升后下降的趋势，在21 d表达量最高。与对照相比表达有变化，但差异不显著。

  讨论

本研究参考拟南芥和水稻UBC家族基因的信息，基于烯效唑处理荔枝花穗转录组数据，利用生物信息学方法全面分析鉴定LcUBC基因家族。结果共鉴定出28个LcUBC基因家族成员，并对其基本理化性质、亚细胞定位进行了分析。通过对LcUBC基因家族蛋白保守结构域分析可看出，LcUBC蛋白的结构域具有高度的保守性，包含典型的保守结构域UBC domain，且含有半胱氨酸活性位点，这与香蕉中UBC蛋白的分析结果一致。

通过转录组及qPCR的结果分析，在荔枝的时空表达和烯效唑处理后的花穗调控中，大多数LcUBC基因家族的表达水平发生了变化，推测这些基因很可能通过参与激素信号转导途径或调控果实相关转录因子的水平，进而影响荔枝果实成熟过程中的各种生理变化。在种子中表达量较高，推测这5个LcUBC家族基因在果实种子发育过程中发挥着重要的作用;在雌花中表达量较高，在雄花中表达量较高，推测这7个LcUBC家族基因在果实花发育过程中发挥着重要的作用;在老叶中表达量较高，而在果皮中表达量较高。多个LcUBC家族基因的表达水平在烯效唑处理后第21天的表达量较高，这表明LcUBC基因家族在该时期调控荔枝花穗发育过程中发挥着关键作用。该研究结果为进一步研究LcUBC基因家族的生物学功能奠定了坚实的基础。

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