年轻女性行新鲜或冻融单囊胚移植妊娠结局比较

吴燕虹 吴升浩 卢晓声 付养华 赵军招

20多年前，多项研究发现，人类胚胎已经可以在体外环境下培养至囊胚期，植入后成功获得了临床妊娠[1,2]。近年来，随着体外培养条件的不断完善，囊胚形成率越来越高。相对于卵裂期胚胎移植，囊胚培养则是一个优胜劣汰的过程，在生理学上与子宫内膜的发育保持更高的同步性，能够提高胚胎种植率及临床妊娠率[3]。随着囊胚移植在辅助生殖中的应用逐渐增多，在获得高妊娠率的同时，也伴随着较高的多胎率，如何在获得满意妊娠结局的同时降低多胎率已成为近年来生殖医学工作者研究的重要方向，有研究表明，单囊胚移植可获得与双卵裂期胚胎组同样满意的妊娠结局，因此，单囊胚移植应该是个理想的选择[4]。目前关于新鲜胚胎和冻融胚胎移植后两者结局差异的文章较多，但针对单囊胚移植在新鲜周期与冻融周期中妊娠结局的差异相关报道则较少。鉴于此，本研究通过比较年轻患者行新鲜或冻融单囊胚移植的妊娠结局，旨在为单囊胚移植进一步提供临床策略。

对象与方法

1.研究对象:回顾性分析2018年1～12月在温州医科大学附属第二医院生殖中心采用新鲜周期或冻融周期单囊胚移植的901例患者临床资料。本研究的入选标准为：移植周期数均为第1次；年龄≤35岁；基础内分泌水平正常；身体健康，无酗酒、吸毒等不良嗜好；超声提示双卵巢、子宫正常，排除不适合本周期移植者。本研究将入选患者根据移植周期不同分为两组，新鲜单囊胚移植周期组(A组)693例，冻融单囊胚移植周期组(B组)208例。将两组中满足临床妊娠条件(排除晚期流产者，包括早产和足月分娩)的患者根据是否发生早期流产分为早期流产组69例和活产组483例。

2.研究方法

(1)新鲜周期：促排卵方案采用卵泡期超长方案或微刺激方案。当有2～3个卵泡直径≥18mm，于当晚9～10时肌内注射绒毛膜促性腺激素(hCG)4000～10000IU扳机。扳机后36～38h，在阴道超声引导下经阴道取卵。获取的卵母细胞常规行IVF/ICSI受精操作及胚胎培养。采用Gardner囊胚分级法进行分级[5]：以数字1～6对囊胚的扩张度和孵化状态进行评分，以字母A、B、C对内细胞团(inner cell mass，ICM) 和滋养外胚层细胞(trophectoderm，TE) 进行评分。优质囊胚的标准定义为3期及3期以上、ICM及TE细胞均为B级及以上者；可利用胚胎定义为3期以上、ICM和TE评分不同时为C者。取卵后第5天选取1枚优质囊胚进行移植，如本周期内无优质囊胚者，则选取1枚可利用囊胚进行移植。移植后黄体支持方案为：自取卵日起，地屈孕酮片(商品名：达芙通，剂量：10毫克/片)，每次20mg，每日2次口服；黄体酮软胶囊(商品名：安琪坦，剂量0.1克/片)，每次0.2g，每日2次口服或阴道给药。

(2)囊胚玻璃化冷冻及解冻：促排卵方案采用不适合新鲜胚胎移植的方案，如黄体期促排卵方案或高孕酮状态下促排卵方案等，或者行卵泡期超长方案或微刺激方案促排卵后，因预防卵巢过度刺激综合征等取消新鲜周期移植。扳机、取卵及囊胚分级同新鲜周期组。胚胎玻璃化冻融采用日本KITAZATO公司的冷冻液和解冻液试剂盒，并按试剂盒说明书中的方法进行操作。

(3)冻融周期：采用激素替代周期或者长效促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin releasing hormone agonist，GnRH-a)降调节联合激素替代方案准备内膜。激素替代周期指在月经周期第2～5天起口服雌二醇片/雌二醇地屈孕酮片(商品名称：芬吗通)中的雌二醇片早晚各1片(含雌二醇2毫克/片)，每隔3～5天予B超监测内膜厚度，根据内膜厚度调整雌二醇片的用量。当子宫内膜厚度≥8mm且孕酮水平<1.5ng/ml时，加用孕激素转化内膜，即口服地屈孕酮片(商品名：达芙通，剂量：10毫克/片)早晚各1片、雌二醇片/雌二醇地屈孕酮片(商品名称：芬吗通)中的雌二醇地屈孕酮片早晚各1片(含雌二醇2毫克/片，地屈孕酮片10毫克/片)以及黄体酮胶囊(商品名：安琪坦，剂量0.1克/片)，早晚各2片口服或阴道给药。GnRH-a降调节联合激素替代周期指在卵泡早期或黄体中期全量肌肉注射注射用曲普瑞林(商品名称：达必佳，3.75毫克/支)进行垂体降调节。注射后的4周则采用激素替代递方案准备子宫内膜。两种方案均于转化日后5天移植1枚优质囊胚，如本周期内无优质囊胚，则选取1枚可利用囊胚进行移植。移植后黄体支持方案同转化日后用药。

(4)随访：胚胎移植后2周，测血清hCG水平以确定是否妊娠。胚胎移植后4周，阴道超声检查发现宫内有孕囊者为临床妊娠；血hCG≥15mlU/ml或者尿妊娠试验阳性，但超声检查未见孕囊者为生化妊娠；发生在妊娠12周前的流产为早期流产，而发生在12周或之后者为晚期流产。妊娠满28周至不足37周间分娩者为早产。出生体重<2500g的婴儿,称为低出生体重儿，出生体重≥4000g的婴儿,称为巨大儿。

结 果

1.两组患者基本情况及实验室结局比较:B组的获卵数明显多于A组，差异有统计学意义(P<0.05),详见表1。

表1 两组患者基本情况及实验室结局比较

2.两组患者妊娠结局比较:B组的早期流产率明显高于A组，差异有统计学意义(P<0.05),详见表2。

表2 两组患者妊娠结局比较

3.早期流产组和活产组单因素比较：两组在配偶年龄、高血压、糖尿病等慢性疾病史、冻融胚胎移植、既往流产次数、早期自然流产史等方面比较，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表3。

表3 两组早期流产因素比较[n(%)]

续表3

续表3

4.早期流产危险因素的多因素Logistic回归:以是否发生早期流产作为因变量，将单因素分析中有意义的变量进一步行多因素Logistic回归分析，得出配偶年龄、冻融胚胎移植是早期流产发生的独立危险因素(P<0.05)，详见表4。

表4 早期流产危险因素的Logistic回归分析

讨 论

新鲜胚胎移植及冻融胚胎移植是目前体外胚胎移植的两种方式，分别受到不同因素的影响。在新鲜胚胎移植周期，COH过程影响机体激素分泌，高雌激素微环境可能导致子宫内膜成熟度提前、影响子宫内膜容受性、影响胎盘形成及血供等，从而导致不良的围产期及新生儿结局[6，7]。而冻融胚胎移植周期虽然可避免大量促性腺激素的刺激，提供的宫腔环境更适合生理状态，但胚胎冷冻可能导致胚胎卵裂球损伤，对母婴结局的影响仍存争议[8]。

Ishihara等[9]研究发现，与新鲜单囊胚移植比较，冻融单囊胚移植可获得与其相似的妊娠结局，且不增加流产率的发生。而Wei等[10]则认为冻融单囊胚移植的种植率、单胎活产率、总活产率及生化妊娠率显著高于新鲜单囊胚移植，差异有统计学意义(P<0.05)，而流产率前者则低于后者，但差异无统计学意义(P>0.05)。本研究中入选患者的年龄不超过35岁，基础内分泌水平功能正常者，均为首次取卵及移植，可有效避免高龄、卵巢功能减退以及反复种植失败的患者可能对研究结果造成的不利影响。研究结果显示，新鲜单囊胚移植组与冻融单囊胚移植组同样能获得满意的妊娠结局，且两组在生化妊娠及晚期流产等不良妊娠情况比较，差异无统计学意义。但需要注意的是，冻融单囊胚移植组早期流产率明显高于新鲜单囊胚移植组，差异有统计学意义(P<0.05)。

本研究对早期自然流产进行的单因素分析结果显示，包括冻融胚胎移植在内的5个方面比较，差异有统计学意义(P<0.05)，进一步将其进行多因素Logistic回归分析，提示冻融周期移植是早期流产的独立危险因素。究其原因，可能是早期流产一般与胚胎质量相关，冻融胚胎经过冷冻、解冻过程可不同程度降低胚胎自身活性。有研究发现，玻璃化冷冻组胚胎染色体异常的发生率显著高于新鲜胚胎移植组[11]。Ma等[12]研究发现，冻融胚胎移植并非能够逆转新鲜胚胎移植对胚胎基因甲基化造成的影响，而是会对胚胎造成新的甲基化紊乱。Hiura等[13]对冻融胚胎移植、新鲜胚胎移植及自然妊娠后获得足月单胎分娩的人胎盘进行了微阵列基因芯片分析，同样得出低温冷冻会对胚胎的表观遗传产生影响。研究提示，虽然胚胎冷冻技术也在不断进步和改善，但胚胎冷冻无疑增加了对胚胎的人为干预，容易对胚胎造成不良影响，从而可能导致早期流产。此外，冻融移植周期子宫内膜准备方案可能与早期流产相关，有研究显示似乎激素替代周期方案更易导致流产，原因在于该方案相较于自然周期，E2水平更高，而血清高水平的E2通过调节子宫内膜基因的表达影响子宫内膜的容受性进而影响妊娠结局[14]。因此，未来仍需更多的研究来评估胚胎冷冻技术及子宫内膜准备方案对胚胎基因表达调控、子代健康的近、远期安全性的影响，使研究能够更好地使用胚胎冷冻保存技术为人类的健康服务。

有报道显示，冻融移植周期新生儿畸形率更高[15]。但也有研究发现冻融胚胎移植未明显增加单胎子代畸形的风险[16]。本研究中暂未发现两组在新生儿畸形率及病死率方面比较，差异有统计学意义。对于新生儿子代体重的影响，一项Meta分析同样显示冻融胚胎移植巨大儿、大于胎龄儿发生率高于新鲜胚胎移植组，而早产、低体重儿、小于胎龄儿发生率则低于后者[17]。冻融胚胎移植子代与新鲜胚胎移植子代体重比较，差异有统计学意义，有研究认为这可能与冻融胚胎的表观遗传学改变及新鲜胚胎移植时母体高激素血症有关[18]。但在本研究中，新鲜单囊胚移植组与冻融单囊胚移植组出生新生儿在出生体重、新生儿性别比、巨大儿、低体重儿发生率等方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)。可能是因为在促排卵周期，对于卵巢高反应者或具有OHSS高危因素的患者，本中心的做法是尽可能建议其放弃新鲜胚胎移植，考虑行全胚冷冻，从而进一步减少新鲜胚胎移植中母体高激素血症对产科结局的影响。另外，单囊胚移植也大大减少了多胎妊娠的发生，从而进一步减少了早产儿、低出生体重儿等不良产科结局的发生。这些推断为解释冻融单囊胚移植与新鲜单囊胚移植子代未发现差异有统计学意义提供了新思路，但仍需进一步深入研究。

2018年，中华医学会生殖医学分会关于胚胎移植数目的中国专家共识已提出建议选择性单胚胎移植，鉴于良好的囊胚培养技术，中国推行单囊胚移植的时机已成熟。在年轻患者(≤35岁)中，与新鲜单囊胚移植比较，冻融单囊胚移植可以获得同样满意的妊娠结局，且未增加新生儿不良出生结局的风险。对于获卵数较多、卵巢高反应、具有OHSS高危因素或输卵管因素性不孕、既往有宫外孕史等异位妊娠高风险人群而言，行冻融单囊胚移植可作为一种优先考虑的临床移植策略，值得临床推广，但需要警惕的是，冻融胚胎移植使早期流产发生风险增加，需要进一步寻找原因和对策解决。