复方七芍降压片对自发性高血压大鼠肾动脉重塑的影响

曾勇， 文爱珍， 符艳， 柳玉佳， 李弘， 范伏元， 游海

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南长沙 410208）

高血压病是一种严重危害人类健康的常见心血管系统疾病，我国成人高血压病患病率达到27.9%[1]。随着研究的不断深入，高血压病不再被认为仅仅是血液动力学的改变，而是伴随着炎症水平上升和心血管重塑等的病理过程[2]。血管重塑是高血压病靶器官损害的病理基础，也是患者心血管事件发生率和死亡率上升的主要原因[3]。因此，开发有效治疗高血压病血管重塑的药物具有重要的临床意义。中医药立足于辨证论治，可多层次、多靶点进行整体调节，且作用温和、疗效确切，在高血压病血管重塑的防治中，其作用受到越来越多的关注。高血压病归属于中医学“眩晕”“头痛”的范畴。复方七芍降压片具有养阴柔肝、活血通脉的功效，前期研究发现复方七芍降压片能降低高血压患者及自发性高血压大鼠（SHR）血压[4]，对SHR血管重塑有较好的调节作用[5-6]，但其具体机制尚不清楚。本研究以SHR 为研究对象，采用在体实验，探讨复方七芍降压片干预逆转SHR 肾动脉重塑的可能机制。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1. 1动物SPF 级雄性SHR 30 只，6 ～7 周龄，体质量130 ～150 g；SPF 级雄性WKY 大鼠10 只，6 ～7 周龄，体质量130～150 g。均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。动物质量合格证号：11400700359571；动物生产许可证号：SCXK（京）2016-006；实验动物环境设施合格证号：SYXK（湘）2015-0003。

1.2 药物复方七芍降压片由三七、白芍、天麻、丹参、桑寄生、杜仲、罗芙木、地龙、葛根、炒香附、甘草组成，0.46 g/片，由湖南中医药大学第一附属医院制剂室制备，批号：20181026，人临床日用量为12 片，相当于含生药量97 g；厄贝沙坦片，75 mg/片，由扬子江药业集团北京海燕药业有限公司生产，批号：17122111，人临床日用量为300 mg。

1. 3试剂与仪器Ⅰ型胶原（COⅠ）、Ⅲ型胶原（COⅢ）抗体（北京Bioss公司）；免疫球蛋白（IgG）-辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体（长沙丽欣生物有限公司）。H1850型低速台式离心机（湖南湘仪仪器有限公司）；超低温冰箱（杭州旭清科技有限公司）；BMJ-1n型病理组织包埋机和包埋冷冻台（上海珂淮仪器有限公司）；TS-12F 型生物组织自动脱水机（上海华岩仪器设备有限公司）；LKB-Ⅲ型超薄切片机（广州华俊科技有限公司）；倒置显微镜和照相装置（日本Olympus公司）；KS400 型图像分析仪（德国Zisse公司）。

1.4 分组与给药30只SHR根据给药前血压和体质量，随机分为模型对照组、厄贝沙坦片组、复方七芍降压片组，每组10 只；另设10 只WKY 大鼠为正常对照组。厄贝沙坦片组给予相当于临床等效剂量的厄贝沙坦片混悬液（27 mg·kg-1·d-1）灌胃；复方七芍降压片组给予相当于临床等效剂量的复方七芍降压片混悬液（496.8 mg·kg-1·d-1）灌胃；正常对照组和模型对照组给予等体积蒸馏水（10 mL·kg-1）灌胃。每天1 次，连续给药6周。每周测量1次血压和体质量，根据每周体质量调整下周给药量。

1.5 苏木素-伊红染色法观察肾动脉组织病理形态麻醉大鼠后，开腹，迅速分离肾动脉，生理盐水冲洗干净，于40 g/L多聚甲醛中固定，梯度乙醇脱水，浸蜡包埋，切厚度为4 μm 的切片，苏木素-伊红染色，中性树胶封片，光镜下观察、拍照。运用计算机图像分析系统测量管壁厚度、血管中膜厚度及相同位置的管腔直径，计算血管中膜厚度与管腔直径的比值。

1.6 免疫组织化学法检测肾动脉组织COⅠ、COⅢ表达蜡块常规切片，脱蜡至水，分别加入COⅠ、COⅢ抗体孵育（37 ℃，2 h），IgG-HRP标记抗体孵育30 min。DAB 显色，脱水封片，于光镜显微镜下拍照，并釆用MOTIC 图像分析软件对所取图片定量分析，测定阳性反应产物的平均光密度，COⅠ、COⅢ阳性着色表现为散在或片状的棕黄色或棕褐色颗粒。

1.7 统计方法采用SPSS 24.0统计软件进行数据处理，实验数据以均数±标准差（±s）表示。多组比较采用重复测量方差分析和单因素方差分析，各组间两两比较采用LSD法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肾动脉组织病理形态学比较经药物干预6周后，与正常对照组比较，模型对照组大鼠的肾动脉内膜粗糙不平，甚至有内膜脱落情况，平滑肌细胞数量增加、分布不均匀、排列紊乱；与模型对照组比较，厄贝沙坦片组大鼠肾动脉内膜欠平整，无明显内膜脱落情况，血管平滑肌细胞数量增多、分布不均匀、排列不同程度紊乱，而复方七芍降压片组大鼠肾动脉内膜欠平整，无内膜脱落情况，血管平滑肌细胞数量无增多、分布尚均匀、排列无明显紊乱。具体结果见图1。结果表明，复方七芍降压片能够改善高血压大鼠受损的肾动脉组织形态。

图1 各组大鼠肾动脉组织病理形态学特征比较（HE染色法，×400）Figure 1 Comparison of pathemorphological features of renal artery between various groups of rats（by HE staining method，×400）

将获得的图片应用计算机图像分析系统测量其血管管壁厚度、中膜厚度及相同位置的管腔直径，并计算后二者比值。与正常对照组比较，模型对照组大鼠血管管壁厚度、中膜厚度/管腔直径比值明显升高（P＜0.01）；药物干预后，与模型对照组比较，厄贝沙坦片组和复方七芍降压片组大鼠血管管壁厚度、中膜厚度/管腔直径比值明显降低（P＜0.05）。具体结果见表1。

表1 各组大鼠肾动脉管壁厚度和中膜厚度/管腔直径比值比较Table 1 Comparison of renal arterial wall thickness and ratio of mid-membrane thickness/lumen diameter between various groups of rats （±s，n=3）

表1 各组大鼠肾动脉管壁厚度和中膜厚度/管腔直径比值比较Table 1 Comparison of renal arterial wall thickness and ratio of mid-membrane thickness/lumen diameter between various groups of rats （±s，n=3）

①P＜0.01，与正常对照组比较；②P＜0.05，③P＜0.01，与模型对照组比较

组别正常对照组模型对照组厄贝沙坦片组复方七芍降压片组中膜厚度/管腔直径比值0.221±0.036 0.545±0.119①0.385±0.015②0.358±0.017②鼠数/只10 10 10 10管壁厚度/μm 422.938±63.772 631.120±13.939①513.410±50.865②440.585±18.748②中膜厚度/μm 91.241±14.911 105.323±12.915①116.669±28.941②109.046±20.190②管腔直径/μm 421.422±94.994 225.303±77.544①303.489±61.249③297.017±57.096③

2.2 各组大鼠肾动脉中COⅠ、COⅢ蛋白表达的比较光镜下可见：正常对照组大鼠肾动脉组织呈弱阳性染色，内膜光滑；模型对照组大鼠肾动脉组织呈强阳性染色，内膜损伤明显，平滑肌细胞数目增多，排列紊乱；厄贝沙坦片组和复方七芍降压片组大鼠肾动脉组织呈弱阳性染色，内膜损伤较模型对照组得到改善。COⅠ、COⅢ阳性表达主要定位于细胞浆。结果见图2、图3。

图2 各组大鼠肾动脉COⅠ阳性表达的比较（免疫组织化学法，×400）Figure 2 Comparison of COⅠpositive expression in renal artery between various groups of rats（by immunohistochemistry，×400）

图3 各组大鼠肾动脉COⅢ阳性表达的比较（免疫组织化学法，×400）Figure 3 Comparison of COⅢpositive expression in renal artery between various groups of rats（by immunohistochemistry，×400）

与正常对照组比较，模型对照组大鼠肾动脉中COⅠ、COⅢ蛋白表达的平均光密度均明显增加（P＜0.01）；药物干预后，与模型对照组比较，厄贝沙坦片组和复方七芍降压片组大鼠肾动脉中COⅠ、COⅢ蛋白表达的平均光密度均明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）。结果见表2。

表2 各组大鼠肾动脉CO I和CO Ⅲ平均光密度值的比较Table 2 Comparison of mean optical density values of CO I and CO Ⅲin renal artery between various groups of rats （±s）

表2 各组大鼠肾动脉CO I和CO Ⅲ平均光密度值的比较Table 2 Comparison of mean optical density values of CO I and CO Ⅲin renal artery between various groups of rats （±s）

①P＜0.01，与正常对照组比较；②P＜0.05，③P＜0.01，与模型对照组比较

COⅢ0.391±0.042 0.436±0.034①0.397±0.088③0.415±0.066③组别正常对照组模型对照组厄贝沙坦片组复方七芍降压片组鼠数/只10 10 10 10 COⅠ0.504±0.060 0.530±0.054①0.526±0.030②0.529±0.035③

3 讨论

高血压病引发的血管重塑进一步发展会导致一系列的靶器官损伤[7]。小动脉、微动脉和毛细血管的结构与功能改变也是心脑血管疾病形成靶器官损害的重要病理基础[8]。而肾动脉作为阻力血管，其功能和结构改变会诱导血管重塑的发生，造成血液中舒血管活性物质的减少，使血压进一步升高，出现靶器官损伤，形成恶性循环[9]，且这种表现比主动脉表现得更加显著[10]。而厄贝沙坦降压的同时可以改善血管重塑[11]。因此，本研究以厄贝沙坦片为阳性对照药，针对SHR 肾动脉的重塑机制及中药干预作用进行实验研究。

血管重塑最典型的特征为内膜内皮细胞肿胀，血管中膜平滑肌细胞（VSMC）增生和外膜细胞外基质（ECM）COⅠ、COⅢ等沉积。VSMC 发生增生、肥大和向内膜迁移时，会造成血管壁肥厚、管腔减小，这是导致血管重塑的关键机制之一[12]。在生理状态下，VSMC 通常处于收缩型的静止状态；当处于高血压等病理状态时，VSMC会由收缩型向合成型转变，呈现高增殖速率、迁移率，导致管腔比率下降，中膜比率升高，引发血管重塑[13-15]。高血压病整个病程中伴随着血管重塑。早期由于体内交感神经末梢合成、释放去甲肾上腺素增多，小动脉（如肾动脉）平滑肌细胞内Na+-K+-ATP酶活性降低，胞内游离Ca2+水平升高，表现为小动脉平滑肌对各种刺激反应性增强，引起小动脉重塑，随着病程进展合并出现中、大动脉血管重塑[16]。本研究通过HE 染色观察，结果显示，与正常对照组比较，模型对照组大鼠肾动脉内膜损伤，中膜VSMC 数量增加、排列紊乱，管壁肥厚，管腔减小，提示处于高血压等病理状态时，肾动脉管壁肥厚、管腔减小，可能引发动脉重塑。给予复方七芍降压片干预后，上述现象得到了改善。通过免疫组织化学法检测发现，与正常对照组比较，模型对照组大鼠肾动脉中COⅠ、COⅢ表达水平均升高，提示高血压肾动脉管壁中COⅠ、COⅢ胶原产生，导致血管重塑。复方七芍降压片干预后，与模型对照组比较，大鼠肾动脉COⅠ、COⅢ表达水平均降低，提示复方七芍降压片可减少胶原生成，缓解血管重塑。

综上所述，复方七芍降压片可改善SHR 肾动脉重塑，抑制肾动脉重塑的机制与抑制平滑肌细胞的增殖、迁移及COⅠ、COⅢ胶原蛋白沉积有关。