骐龙血脉健方对ApoE-/-小鼠主动脉功能及TSP-1/CD36介导血小板活化的影响

封 锐，王丹丹，师 帅，李树斌，姜 北，胡元会，

动脉粥样硬化是冠心病、脑卒中等多种血管疾病的发病基础。研究表明，70%～80%的动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)是易损斑块和继发血栓形成所导致的[1]，而血小板的活化、黏附、聚集是血栓形成的初始环节[2]。这些动脉硬化性心血管疾病属中医“痰浊”“血瘀”的范畴，而痰与瘀密切相关，日久可相互搏结而致病，现代研究发现，血小板活化、内皮损伤、血栓形成等均为痰瘀证的病理表现[3-5]。胡元会教授潜心研究多年创制的骐龙血脉健方是治疗痰瘀互结型心脑血管疾病的有效方剂，本研究通过复制载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠动脉粥样硬化模型，探究骐龙血脉健方对主动脉功能和血小板反应蛋白-1(TSP-1)/CD36介导血小板活化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 骐龙血脉健方(配方颗粒，四川新绿色药业研制)，由黄连、全瓜蒌、法半夏、血竭、茯苓等组成，阿托伐他汀钙片(商品名：立普妥，辉瑞公司生产)。

1.1.2 动物与饲料 选用无特定病原体(SPF)级 8 周龄雄性 ApoE-/-小鼠 40 只及C57BL/6J野生型小鼠 8 只，购自北京维通利华公司，许可证SCXK(京)2016-0006，于中国中医科学院广安门医院实验动物中心饲养。以西方饮食饲料(脂肪 21%、胆固醇 0.15%)饲养 ApoE-/-小鼠；以标准饲料喂养C57BL/6J 小鼠。本实验严格遵守国家动物福利伦理及保护规定进行动物饲养及操作。

1.1.3 主要设备与器械 低温高速离心机(Sigma，Germany)、MSE125P-1CE-DU精密电子分析天平(Sartorius，Ger3many)，Navios 流式细胞仪， Vevo 2100超高分辨率小动物超声影像系统(Visual Sonics，Canada)。

1.1.4 主要试剂 Anti-Thrombospondin 1 抗体(Abcam，England，ab85762)，Ms CD61FITC 2C9.G2 100 μg(BD Pharmingen，China，561911)，Ms CD62P Alexa 647 RB40.34 50 μg(BD Pharmingen，China，563674)，Ms CD36PE CRF D-2712 100 μg(BD Pharmingen，China，562702)

1.2 方法

1.2.1 实验分组及建模 将 40只8周龄雄性ApoE-/-小鼠按随机数字表法分为模型组、立普妥组、中药大剂量组、中药中剂量组、中药小剂量组，每组8只，予高脂饮食喂养14周。另选取8只8周龄雄性C57BL/6J小鼠作为空白组，予以标准饲料喂养。

1.2.2 给药方法 以0.9%氯化钠注射液将中药配方颗粒配成中药混悬液，随用随配，置于 4 ℃冰箱保存，并以0.9%氯化钠注射液将阿托伐他汀钙片配成药品溶液，与中药混悬液同样条件保存。空白组及模型组以每天10 g体重0.1 mL给予氯化钠注射液(0.009 g/mL)；立普妥组以每天10g体重0.1mL给予立普妥溶液(0.300 3 mg/mL)；中药大剂量组以骐龙血脉健方临床用量的20倍(36.04 g/mL)、中剂量组以骐龙血脉健方临床用量的10倍(18.02 g/mL)、小剂量组以骐龙血脉健方临床用量的5倍(9.01 g/mL)配制溶液，按照10 g体重0.1 mL进行灌胃。每日灌胃1次，共持续14周，实际用药量根据每周体重动态调整。

1.2.3 取材及处理 末次灌胃完成后，所有小鼠空腹 12 h后取材。①取血：以摘眼球方式获得血液，采集后置于采血管中保存，以3 000 r/min(4 ℃)速度离心10 min，分离得到血清和血浆，置于-80 ℃冰箱保存。 ②取材：脱臼法处死实验动物后，小心剪开皮肤及腹膜，打开胸腔剪除脏器，使用注射器将0.9%氯化钠溶液从小鼠心尖部注入左心室进行冲洗。小心地分离主动脉周围的脂肪直至完整暴露。随后小心剥离主动脉束，置于冻存管中，液氮冷冻后迅速置于-80 ℃冰箱内保存[6]。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 小鼠腹主动脉内径超声影像检测 造模结束前 3 d，腹腔注射巴比妥钠麻醉小鼠，控制心率在 350 次/min左右，麻醉成功后，平卧位固定小鼠，腹部备皮，采用超声影像系统测定小鼠腹主动脉收缩末期内径(systolic diameter，Ds)、舒张末期内径(diastolic diameter，Dd)。Ds及Dd均测量3次，取平均值。

1.3.2 主动脉TSP-1蛋白检测 采用蛋白印迹法测定小鼠主动脉TSP-1 蛋白表达[7]。

1.3.3 血小板活化率及CD36表达率检测 采用流式细胞技术检测血小板活化率及CD36表达率，建立前向角(FSC)-侧向角(SSC)散点图，参照空白和同型对照，调节仪器阈值、FSC，FL1、FL2、FL6 通道增益和电压，以收取 5万个阳性事件为终止条件。先在前色相中标记出 CD61+的部分，作为C门；以CD61+/CD36+区域为D门；CD61+/CD62P+区域为E门。CD36+CD62P-CD61+%为血小板CD36表达率；CD36-CD62P+CD61+%为血小板活化率。

2 结 果

2.1 各组小鼠腹主动脉Ds、Dd比较 与空白组比较，模型组主动脉Ds及Dd明显减小(P<0.01)。与模型组比较，立普妥组与中药大剂量组主动脉Ds及Dd明显增大(P<0.01)，中药中剂量组、小剂量组主动脉Ds均明显增大(P<0.01)，中药中剂量组主动脉Dd增大(P<0.05)，中药小剂量组Dd增大不明显(P>0.05)。详见表1及图1、图2。

表1 各组小鼠腹主动脉Ds、Dd比较(±s) 单位：mm

与空白组比较，＊P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，△ P<0.01。图2 各组小鼠腹主动脉Ds、Dd柱状图

图1 各组小鼠腹主动脉超声图

2.2 各组小鼠主动脉TSP-1蛋白表达比较 与空白组比较，模型组主动脉TSP-1 蛋白表达明显升高(P<0.01)。与模型组比较，立普妥组、中药大剂量组 TSP-1蛋白表达明显减少(P<0.01)，中药中剂量组TSP-1 蛋白表达也减少(P<0.05)，中药小剂量组 TSP-1 蛋白表达与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2及图3。

表2 各组小鼠主动脉TSP-1蛋白表达比较(±s)

与空白组比较，＊P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，△ P<0.01。图3 各组小鼠主动脉TSP-1蛋白表达情况

2.3 各组小鼠血小板CD36表达率比较 与空白组比较，模型组血小板CD36表达率明显增加(P<0.01)。与模型组比较，立普妥组与中药大剂量组血小板CD36表达率明显降低(P<0.05)。中药中剂量组、中药小剂量组CD36表达率与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表3及图4、图5。

表3 各组小鼠血小板CD36表达率比较(±s) 单位：%

图4 流式细胞仪检测各组小鼠CD36表达率水平结果(A为空白组；B为模型组；C为立普妥组：D为中药大剂量组；E为中药中剂量组；F为中药小剂量组)

与空白组比较，＊P<0.01；与模型组比较，#P<0.05。图5 各组小鼠CD36表达率柱状图

2.4 各组小鼠血小板活化率比较 与空白组比较，模型组血小板活化率明显升高(P<0.01)。与模型组比较，立普妥组与中药大剂量组血小板活化率明显降低(P<0.05)。中药中、小剂量组血小板活化率与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表4及图6、图7。

表4 各组小鼠血小板活化率比较(±s) 单位：%

图6 流式细胞仪检测各组小鼠血小板活化率结果(A为空白组；B为模型组；C为立普妥组：D为中药大剂量组；E为中药中剂量组；F为中药小剂量组)

与空白组比较，＊P<0.01；与模型组比较，#P<0.05。图7 各组小鼠血小板活化率柱状图

3 讨 论

血小板活化与聚集对血栓形成至关重要[8]，在血管内皮受损及血流剪切力改变时，血小板黏附、活化和聚集发生，导致血栓形成。血小板活化会刺激细胞因子大量释放，而释放的细胞因子又会介导早期血管反应，使血小板活化加速，并促进黏附分子表达以及巨噬细胞的募集[9-10]。活化血小板释放的主要蛋白包括TSP-1[11]，可刺激血管内皮细胞凋亡继而抑制血管新生，并可保护血管性血友病因子(vWF)遭裂解，以及介导血小板的黏附、聚集，参与血栓形成的过程，从而促进动脉粥样硬化的形成。当血管损伤时，受损部位有大量的TSP-1聚集，这些TSP-1是由活化的血小板所释放，诱导钙调素(CAM)表达，促使单核细胞黏附明显增加[12]。除此以外，内皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和血管平滑肌细胞(VSMCs)等多种细胞也可分泌TSP-1[11]。与胚胎比较，健康成年人组织 TSP-1蛋白表达较少[13]。但当组织损伤时，细胞会提高 TSP-1 蛋白表达来促进组织修复[14]，动脉粥样斑块中TSP-1 蛋白表达明显高于健康血管[15]。血小板表面存在 TSP-1的受体CD36，TSP-1可与血小板表面的CD36结合来抑制血管性血友病因子裂解，这一过程能加速血小板活化[16]；另一方面，TSP-1也可能通过抑制 CD36介导的环磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)通路或阻断一氧化氮(NO)/环磷酸鸟苷(cGMP)信号的抗血栓活性来间接介导血小板活化[17]。CD36还是一种双跨膜蛋白[18]，与氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、TSP-1、氧化磷脂(oxPL)和长链脂肪酸有一些共同的结合位点[19-20]，阻断CD36或酪氨酸激酶可抑制 TSP-1 或氧化型低密度脂蛋白的血小板信号反应。既往研究证实，在血小板活化过程中out-in 信号的触发，与TSP-1和氧化型低密度脂蛋白密切相关，而在其中起主要连接作用的就是CD36[21]。在血小板活化过程中，血小板分泌作用的扩大与整联蛋白活化密不可分，而上述反应由CD36所介导，并被血小板自分泌产生的 二磷酸腺苷(ADP)所增强，进而加速血栓形成[22]。在血栓形成过程中，血小板活性增强的同时，伴随着血管内皮功能紊乱，钟慧等[23]研究发现，心肌梗死发病时，血浆中NO分泌受抑制而内皮素-1(ET-1)浓度过高，使用活血化瘀中药注射剂可有效促进梗死后心功能的恢复和心肌组织损伤修复。而Ds和Dd与动脉粥样硬化程度密切相关，高辉等[24]研究发现，活血化瘀中成药可明显改善肱动脉静息时基础内径、反应性充血后内径及血管内皮舒张功能(FMD)、踝臂脉搏波传导速度(BaPWV)。

本研究使用超声影像系统检测小鼠腹主动脉Ds及Dd变化，发现模型组Ds及Dd明显减小。与模型组比较，立普妥组与中药大剂量组Ds及Dd明显增大，考虑与动脉粥样硬化所致管腔狭窄和内皮功能紊乱有关。与空白组比较，模型组主动脉TSP-1 蛋白表达、血小板活化率及CD36表达水平均增高，证明动脉粥样硬化加重时，TSP-1蛋白表达和CD36表达上调，并促进血小板的活化。而立普妥组与中药大、中剂量组对TSP-1蛋白表达、血小板 CD36表达率及血小板活化率均有下调。TSP-1表达升高与血小板活化均能够加速动脉粥样硬化形成。因此，骐龙血脉健方可能通过下调 TSP-1 蛋白的表达，减少血小板CD36水平并且抑制血小板活化的过程，最终达到抗动脉粥样硬化的作用。