贾跃进老中医常用药对半夏-夏枯草治疗失眠障碍作用机制的网络药理学研究

杨青婷，刘 毅，王瑞敏，付 璐，贾跃进

失眠障碍(insomnia disorder，ID)作为一种临床常见病，患病率为10%～20%，是一些躯体和精神疾病发展的危险因素，其特征为在有适当的睡眠条件下，仍持续存在睡眠的启动、维持或质量方面的困难，并伴随某种形式的日间功能损害[1-2]。尽管失眠障碍给人们的身心健康造成了较大的危害，但是目前仍然缺乏理想的治疗药物[3]，而中药治疗失眠障碍临床应用广泛，发挥治疗作用的同时未见不良反应的报道[4]，因此，挖掘中医药可为失眠障碍的药物治疗提供新的思路。

贾跃进老中医是全国名老中医工作室指导老师，有40余年临证经验，尤擅长治疗包括失眠障碍在内的多种神经内科疾病，在治疗失眠障碍时常应用半夏-夏枯草药对，并效验甚众。因此，根据中药多成分、多靶点、多通路的复杂网络特性，选取网络药理学方法研究半夏-夏枯草治疗失眠障碍的有效成分、靶点和通路以探讨其作用机制。

1 资料与方法

1.1 药物有效成分与靶点搜集 以“半夏”“夏枯草”为关键词，在中药系统药理学技术平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)中检索药物有效成分及相关靶点，并按照口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，血脑屏障(blood brain barrier，BBB)≥-0.3，类药性(drug likeness，DL)≥0.18进行筛选，将所得靶点在UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)中匹配基因名。

1.2 疾病靶点与药物-疾病交集靶点搜集 以“insomnia disorder”为关键词在GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/#)及TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)数据库中检索以搜集疾病靶点，并将药物有效成分靶点与其取交集，以Venn图表示。

1.3 疾病-药物-成分-靶点网络和蛋白互作关系(PPI)网络构建 利用CytoscapeV3.6.1构建失眠障碍、半夏-夏枯草、有效成分及相关靶点的相互关系网络，再将交集靶点利用STRING数据库(https://string-db.org/)构建PPI网络，并在Cytoscape中限定节点度以进一步构建核心PPI网络。

1.4 基因本体(gene ontology，GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 在Metascape平台(https://metascape.org/)中导入所得交集靶点并获取GO分子功能、细胞成分、生物过程和KEGG通路富集分析，然后运用在线作图平台ImageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/)绘制富集气泡图。

1.5 核心成分和核心靶点分子对接 通过疾病-药物-成分-靶点网络及PPI网络中的核心有效成分和核心靶点，将其分别在ZINC(http://zinc.docking.org/)、PDB(http://www.rcsb.org/)数据库中匹配3D结构，而没有结构记录的靶点则利用SWISS-MODEL平台(https://swissmodel.expasy.org/)模拟构建其3D结构，然后预处理结构文件，并使用AutoDock vina及PyMol进行分子对接和构象可视化。

2 结 果

2.1 半夏、夏枯草有效成分与靶点搜集结果 通过检索TCMSP数据库及限定药物OB、BBB、DL值筛选有效成分。经去重排除后，半夏-夏枯草药对共搜集到12种有效成分、73个关联靶点。详见表1。

表1 半夏、夏枯草有效成分基本信息

2.2 失眠障碍疾病靶点与药物-疾病交集靶点获取结果 在GeneCards、OMIM和TTD数据库中检索失眠障碍，合并去重后共获得失眠障碍靶点2 916个。将其与半夏-夏枯草药对的73个靶点取交集，得到药物-疾病交集靶点33个，该33个靶点分属10种成分。详见图1。

图1 药物-疾病交集靶点

2.3 疾病-药物-成分-靶点网络和PPI网络构建结果 药对-药物-成分-靶点网络构建结果见图2，有87节点、196条边；疾病-药对-成分-交集靶点网络构建结果见图3，有45个节点、127条边。结合以上两个网络图并利用Cytoscape内置网络分析插件计算节点度，得出节点度大于2倍中位数的核心有效成分5个。再导入33个交集靶点到STRING数据库，设置物种为智人，获得PPI网络(见图4)，以靶点为节点，蛋白互作关系为边，有33个节点数、146条边，平均节点度为8.85，平均局部聚类系数为0.62；同样使用Cytoscape分析PPI网络(见图5)，筛选节点度大于11的靶点为核心靶点并构建网络，可得核心靶点为：低聚果糖(FOS)、蛋白激酶(AKT1)、单胺类氧化酶A(MAOA)、5-羟色胺3A受体(HTR3A)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、5-羟色胺转运体(SLC6A4)、α-(1B)-肾上腺素受体(ADRA1B)。

图2 药对-药物-成分-靶点网络图

图3 疾病-药对-成分-交集靶点网络图(BX-XKC为半夏-夏枯草)

图4 PPI网络图

图5 PPI核心网络图

2.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析结果 在Metascape平台中对交集靶点分别进行GO和KEGG通路富集分析，其中GO富集分析得到540条结果，包括生物过程447条、分子功能56条以及细胞成分37条；KEGG通路富集分析得到37条结果，再限定P<0.01，最小计数为3，富集因子>1.5筛选，绘制富集气泡图(见图6)。富集分析所得主要生物过程包括：腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路、成长调节、单胺运输、膜电位调节等；分子功能主要涉及肾上腺素受体活性、儿茶酚胺结合、神经递质受体活性、单胺跨膜转运蛋白活性等；细胞成分则主要有突触后膜的组成部分、受体复合体等；通路则包含神经活性配体-受体相互作用、血清素能突触、脂肪细胞中的脂肪分解调节等。然后构建通路、交集靶点相互关系的网络(见图7)，其中神经活性配体-受体相互作用通路节点度明显高于其他通路，因此可以判断药对最可能通过该通路发挥作用，其具体作用机制见图8。

图6 富集分析气泡图

图7 靶点-通路关系图

图8 神经活性配体-受体相互作用通路机制

2.5 核心成分与核心靶点分子对接结果 核心成分与核心靶点分子对接结果均小于-20.92 kJ/mol(见表2)，可见核心成分均可能与核心靶点结合成稳定结构。使用Pymol将核心靶点与核心成分对接最稳定的组合的对接构象可视化(见图9)。

表2 核心活性成分与核心靶点分子对接结果 kJ/mol

图9 核心成分与核心靶点分子对接构象图

3 讨 论

失眠障碍相当于中医的“不寐”，贾跃进老中医对于不寐有其独特的认识，其结合《黄帝内经》：“卫气不得入于阴，长留于阳，则阳气满，阳气盛则阳蹻盛，不得入与阴则阴气虚，故不目瞑[5]。”对不寐病理机制进行阐述，认为其总病机为“营卫失和，阴阳不交”[6]，因此，治疗不寐的关键在于调和阴阳、引阳入阴。而《冷庐医话》记载：“盖半夏得阴而生，夏枯草得至阳而长，是阴阳配合之妙也”[7]。故贾跃进老中医常以两药相配，寒温并用，平衡阴阳，引阳入阴，治疗不寐。此外，临床观察证实该药对治疗失眠障碍确有疗效[8]，现代药理学研究则发现该药对有镇静催眠、抗惊厥、抗抑郁等作用[9-10]。综上所述，半夏-夏枯草治疗失眠障碍有其理论和临床依据。

本研究疾病-药物-成分-靶点网络所得的核心成分中，A成分是一种天然植物甾醇，可通过增加γ-氨基丁酸(GABA)、谷胱甘肽(GSH)水平，减少多巴胺(DA)、丙二醛、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平，降低乙酰胆碱酯酶(AChE)活性，对动物精神病症状有一定的改善作用[11]；成分B也是植物甾醇类成分，研究认为其可明显增加小鼠脑中去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)，介导抗抑郁样活性[12]；成分BX3是一种重要的黄酮，在体外和体内系统均具有神经保护特性[13]；BX2是来自多种植物的生物碱，可抑制炎性因子表现出抗炎的作用，而炎性因子亦参与睡眠的调节[14-15]。通过筛选PPI网络所得的核心靶点中，FOS表达涉及唤醒状态的调节[16]；AKT1编码的AKT1激酶则在神经元细胞间通讯、神经元存活和记忆形成中发挥作用；MAOA编码的单胺氧化酶A参与血清素、肾上腺素、NE和DA等神经递质的分解，而这些神经递质参与调控睡眠-觉醒周期；HTR3A编码5-HT受体，SLC6A4编码调控5-HT的膜蛋白，而5-HT是已知的促觉醒和抑制快速眼动睡眠的神经递质[17]；ADRA1B受体参与诱导松果体合成褪黑激素以调控昼夜节律[18]；VEGFA则对GABA能神经元产生影响[19]。

GO富集分析所获得的主要生物过程中以腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路和单胺运输两个生物过程为主，其中是α-肾上腺素能受体功能是动物和人类睡眠-苏醒调节的关键组成部分[20]；而包括DA、血清素和NE在内的单胺类物质则已证实与睡眠-觉醒密切相关。KEGG通路富集分析所得通路则主要以神经活性配体-受体相互作用及血清素能突触为主，目前已知的GABA、5-HT等促睡眠因子及DA、NE等促觉醒因子均通过此通路发挥作用[21]。分子对接结果可得核心成分与核心靶点均可能形成稳定结构，进行数据分析可以进一步筛选出对接较好的关键成分：A(豆甾醇)、BX5(新隐丹参酮)、B(β-谷甾醇)以及对接较好的关键靶点(AKT1、SLC6A4、HTR3A、MAOA)。综合以上中医理论、网络药理学、分子对接以及临床验案，可以得出贾跃进老中医应用半夏-夏枯草药对治疗失眠障碍符合中医“引阳入阴”的治疗大纲，并且临床确有疗效，而其具体则可能由豆甾醇、新隐丹参酮、β-谷甾醇等关键成分结合AKT1、SLC6A4、HTR3A、MAOA等关键靶点，即通过调控AKT1激酶及5-HT、DA等单胺类物质，藉由神经活性配体-受体相互作用及血清素能突触等通路发挥作用。