基于分子对接和网络药理学探讨半枝莲治疗脑梗死的作用机制

聂玉婷，张 磊，司 童，刘 瑶，高 利，曲 淼

脑卒中是世界第二、我国首位的死亡原因，且我国人群脑卒中发病率明显高于世界平均水平[1]。缺血性脑卒中占脑卒中的80%以上，脑卒中后病人大部分遗留残疾，失去工作和生活的能力，给社会和国家造成严重的经济负担。急性脑梗死损伤机制涉及氧化应激、炎症反应、细胞凋亡等多个途径，但是目前多数药物只能针对急性脑梗死病理过程的某一环节，因此，多靶点药物研发迫在眉睫。半枝莲具有清热解毒、活血祛瘀、利尿消肿等功效。有研究表明，半枝莲总黄酮可在一定程度上降低轴索过度生长抑制因子的表达，改善脑缺血小鼠的认知功能[2]。张立波等[3]研究发现，半枝莲总黄酮能减轻急性脑梗死缺血再灌注大鼠大脑皮层神经炎症反应，减轻神经元损伤。沈宏友等[4]给予脑缺血再灌注损伤大鼠半枝莲总黄酮(140 mg/kg)灌胃治疗，发现其可以通过调控细胞凋亡减小脑梗死体积。本研究旨在探索半枝莲治疗脑梗死的网络药理学机制，进一步明确半枝莲治疗脑梗死的作用机制。

1 资料与方法

1.1 筛选半枝莲的关键化合物 通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)，以“半枝莲”为关键词，以口服生物利用度(OB)>30%和药物相似性(DL)>0.18 为条件筛选主要有效活性成分及相应靶点，通过 UniProt 数据库(https://www.uniprot.org)对靶点进行注释。

1.2 疾病靶点筛选 以“cerebral infarction”为关键词在 GeneCards(https://www.genecards.org)与 OMIM(https://omim.org)数据库进行检索，Relevance score设置为≥3，去除重复靶点，筛选脑梗死的疾病靶点。通过R语言包install.packages(“Venn Diagram”)，得到半枝莲-脑梗死共同靶点基因。

1.3 药物-关键化合物-疾病靶点的网络可视化 使用 Cytoscape 3.7.2 软件进行可视化处理，构建“半枝莲-关键化学成分-脑梗死-靶蛋白”网络关系图。

1.4 靶蛋白互作(PPI)网络构建 将半枝莲-脑梗死共有的靶点基因输入String(https://string-db.org/cgi/input.pl)建立靶蛋白互作网络图，将蛋白关系评分设为 0.4，隐藏游离蛋白，得到 PPI 网络图。选取前 20个邻接点最多的基因，用 R 语言绘制柱状图。

1.5 基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析 利用 R 软件安装 Bioconductor相关安装包(“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”)，以P<0.05 为标准，进行GO富集分析和KEGG富集分析。

1.6 核心活性成分-靶点分子对接验证 将PPI网络中节点度值(Degree)参数排名前4位的基因和对应的化合物进行分子对接，利用PyMOL将对接结果可视化。

2 结 果

2.1 半枝莲关键化学成分的筛选 在TCMSP数据库搜索半枝莲的化学成分，得到104个化学成分。以OB>30%且DL>0.18 为标准进行筛选，得到29 个关键化合物。详见表1。

表1 半枝莲关键化学成分

2.2 药物-疾病靶点 去除重复靶点，筛选得到脑梗死的1 714个蛋白靶点基因，通过R语言包install.packages(VennDiagram)得到半枝莲-脑梗死的共同靶点基因57个。共同靶点分别为环加氧酶1(PTGS1)、雌激素受体1(ESR1)、孕酮受体(PGR)、核受体亚家族3C组成员2(NR3C2)、核受体亚家族3C组成员1(NR3C1)、雄激素受体(AR)、雌激素受体2 (ESR2)、糖原合成激酶-3β(GSK3β)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)、胆碱能受体1(CHRM1)、γ-氨基丁酸A型受体α1亚单位(GABRA1)、B淋巴细胞瘤-2基因(BCL2)、半胱氨酸蛋白酶-9 (CASP9)、半胱氨酸蛋白酶-3(CASP3)、半胱氨酸蛋白酶-8 (CASP8)、蛋白激酶Cα(PRKCA)、对氧磷酶1(PON1)、凝血因子Ⅶ(F7)、尿激酶型纤溶酶原激活剂(PLAU)、V-Rel网状内皮增生病毒癌基因同源物A(RELA)、细胞周期蛋白D1(CCND1)、白细胞介素- 6(IL-6)等。韦恩图详见图1。

图1 半枝莲与脑梗死疾病靶点的韦恩图

2.3 “半枝莲-关键化学成分-脑梗死-靶蛋白”网络构建 使用 Cytoscape 3.7.2 构建“半枝莲-关键化学成分-脑梗死-靶蛋白”可视化网络图。在该网络中，共包含节点 86 个，其中半枝莲、脑梗死节点各 1 个，半枝莲有效成分节点27个，半枝莲治疗脑梗死的潜在靶点57 个。其中槲皮素(quercetin)、汉黄芩素(wogonin)、黄芩苷(baicalein)、木犀草素(luteolin)等成分相关的节点数较多，是半枝莲治疗脑梗死的主要有效成分。详见图2。

图2 半枝莲-关键化学成分-脑梗死-靶蛋白网络图

2.4 PPI 蛋白互作网络关系 将半枝莲与脑梗死共同的 57个靶点基因导入 STRING 数据库平台，研究物种选择人类，获取蛋白质相互作用关系，筛选评分>0.4分的蛋白关系，并绘制蛋白互作关系网络图，详见图3。通过计算每个基因的连接节点数目，得到前 20个PPI核心基因，为IL-6、CASP3、血管内皮生长因子-A(VEGF-A)、表皮生长因子受体(EGFR)、ESR1、MYC、CCND1、AR、FOS、PPARG、细胞色素C(CYCS)、RELA、内皮一氧化氮合成酶(NOS3)、CAV1、APP、CASP8、缺氧诱导因子-1A(HIF-1A)、NR3C1、PGR、CASP9，即半枝莲治疗脑梗死的核心基因，前5位分别为IL-6、CASP3、VEGF-A、EGFR、ESR1，涉及的信号途径包括血管生成、炎症、细胞凋亡等。详见图4。

图3 半枝莲-脑梗死靶点PPI网络图

图4 半枝莲-脑梗死靶点PPI网络柱状图

2.5 GO功能富集分析 GO功能富集分析结果显示，共获得 73条GO生物学过程，靶点基因主要富集于类固醇激素受体活性(steroid hormone receptor activity)、类固醇结合(steroid binding)、DNA结合转录因子(DNA-binding transcription factor binding)、配体激活转录因子活性(ligand-activated transcription factor activity)、RNA聚合酶Ⅱ-特异性DNA结合转录因子结合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)、DNA结合转录激活剂活性及RNA聚合酶Ⅱ-特异性(DNA-binding transcription activator activity，RNA polymerase Ⅱ-specific)、DNA结合转录激活剂活性(DNA-binding transcription activator activity)、激活转录因子结合(activating transcription factor binding)、泛素蛋白连接酶结合(ubiquitin protein ligase binding)等生物学过程。详见图5。

图5 GO功能富集分析气泡图

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析结果显示，半枝莲治疗脑梗死的关键基因靶点主要富集的通路有109条，其中与脑梗死密切相关的信号通路主要有糖尿病并发症晚期糖基化终末产物与其受体信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流体剪切应力与动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、细胞凋亡通路(apoptosis)、p53信号通路(p53 signaling pathway)等。详见图6。

图6 KEGG 功能富集柱状图

2.7 半枝莲治疗脑梗死活性成分干预关键靶点的分子对接预测 网络药理学预测关键靶点为IL-6、CASP3、VEGFA、EGFR，使用 AutoDock Vina软件对关键靶点与对应化合物进行对接，结合能≤-5 kJ/mol证明分子与靶点对接较好，分子对接结果显示IL-6与木犀草素、槲皮素、汉黄芩素，CASP3 与木犀草素、槲皮素、汉黄芩素、黄芩苷，VEGFA与木犀草素、槲皮素、黄芩苷，EGFR与槲皮素、木犀草素具有较好的结合力，详见表2。将关键靶点与结合能最低的活性化合物用PyMoL作图，详见图7。

表2 半枝莲有效化合物与作用靶蛋白的结合分数情况

图7 分子对接图

3 讨 论

本研究共检索出半枝莲的有效化学成分29种，其中槲皮素、汉黄芩素、黄芩苷、木犀草素是半枝莲治疗脑梗死的主要有效成分。槲皮素具有抗炎、抗凋亡[5]、神经保护[6]、抗氧化[7]、抗动脉粥样硬化[8]、抗肿瘤[9]等作用，腹腔注射槲皮素(30 mg/kg)能明显缩小脑梗死面积，减少神经行为缺损，抑制神经元丢失[10]。另外，槲皮素明显抑制缺血诱导的基质金属蛋白酶-9(MMP-9)升高，减轻全脑缺血诱导的神经元损伤[11]。汉黄芩素具有抗炎、抗氧化[12-13]、抗肿瘤[14]等作用，可明显改善促进慢性脑缺血区细胞增殖和血管发生，减轻炎症反应[15]。Ahang等[16]研究发现黄芩苷可以促进脑源性神经生长因子(BDNF)的表达，抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表达，减轻脑缺血再灌注损伤。在大脑中动脉闭塞模型中，黄芩苷可以抑制MMP-9表达，减轻其所致的神经元损伤、脑水肿和血脑屏障通透性[17]。黄芩苷抑制脑缺血时Toll样受体2(TLR2)/ Toll样受体4(TLR 4)信号通路，这可能是黄芩苷神经保护作用的机制之一[18]。一项动物研究提示，黄芩苷对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用是由肠道微生物区系介导的，黄芩苷可能通过重塑肠道微生物来改善脑缺血-再灌注模型小鼠的神经功能，抑制神经炎症反应，使肠道微生物组成恢复正常[19]。木犀草素具有抗菌、抗病毒、抗炎、镇痛[20]、抗肿瘤[21]的作用。木犀草素通过下调炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和IL-6，上调抗氧化激酶活性，减轻脑缺血损伤程度[22]。

由PPI网络获得关键靶点，得到前 20个PPI核心基因，为IL-6、CASP3、VEGFA、EGFR、ESR1、MYC、CCND1、AR、FOS、PPARG、CYCS、RELA、NOS3、CAV1、APP、CASP8、HIF-1A、NR3C1、PGR、CASP9，排在前3位的是IL-6、CASP3、VEGFA。对关键靶点进行分析，脑梗死后炎症和凋亡是梗死后损伤的关键环节。IL-6是重要的炎性因子，急性脑卒中病人血浆IL-6水平升高，IL-6水平升高与较大的梗死体积和不良预后相关[23]。半枝莲总黄酮可通过降低IL-6等炎性因子水平而发挥抗动脉粥样硬化的作用[24]。Caspase-3是凋亡酶级联反应中的重要蛋白，其下调可减轻神经细胞凋亡和脑缺血再灌注损伤，缺血半暗带可能是Caspase-3介导的[25]。一项动物实验证明，半枝莲通过调节Caspase-3、Caspase-9抑制神经细胞凋亡[26]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)对缺血性脑卒中起重要作用，是最强的缺氧诱导血管生成因子[27]，目前对VEGFA的研究最广泛。VEGFA可通过改善脑缺血再灌注来挽救神经组织，并参与侧支血管形成。通过以上分析可以发现这些靶点与缺血性脑卒中主要富集于炎症反应、细胞凋亡、血管生成等方面。

根据KEGG通路富集分析结果推测半枝莲可能通过干预糖尿病并发症晚期糖基化终末产物与其受体信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、细胞凋亡通路、p53信号通路发挥治疗脑梗死的作用。晚期糖基化终产物受体上调可引起肿瘤坏死因子-α表达，参与脑缺血损伤过程[28]，另有文献表明，晚期糖基化终产物受体可增强血管损伤和胶质细胞介导炎症而导致迟发性神经元死亡[29]。动脉粥样硬化与剪切应力密切相关，是脑卒中的主要原因，已有研究表明，半枝莲可以调节血清磷脂转运蛋白水平，改善血脂、血液流变学，进而减少动脉粥样硬化损伤[30]。p53是参与脑缺血损伤后神经细胞凋亡的重要因子，具有促凋亡作用，在大鼠急性全脑缺血再灌注模型中，p53蛋白表达增加，神经细胞凋亡和 p53蛋白的表达在一定时间内呈正相关[31]。有实验研究表明，半枝莲能减弱Bax和p53 蛋白表达、减少大鼠神经细胞凋亡[32]。

综上所述，本研究采用网络药理学方法，预测了半枝莲防治脑梗死的主要化学成分、关键靶标，明确了半枝莲通过多成分、多靶点、多途径作用于脑梗死，为半枝莲用于改善脑梗死的药物研究提供了依据。