基于肿瘤数据库分析THBS2 基因mRNA 在人恶性胸膜间皮瘤的表达及意义

李 彬，李素芬，杨 娜，熊 伟*

（1.大理大学基础医学院，云南大理 671000；2.云南省高校临床生物化学检验重点实验室，云南大理 671000）

恶性胸膜间皮瘤（malignant pleural mesothelioma，MPM）为侵袭性高的罕见恶性肿瘤〔1〕。据报道MPM 的发病主要与石棉接触相关，由于发达国家曾有悠久的石棉使用历史，发展中国家目前仍在使用及生产石棉，因此MPM 的发病率在世界范围内仍在逐年升高，发达国家中英国、澳大利亚等国发病率最高，发展中国家中中国发病率最高，其中，国内发病率最高地区为云南省〔2-3〕。由于MPM 发病罕见，且目前诊断的通用检查指标是CT 或胸腔镜活检〔4〕，缺乏早期的诊断方法及标志物，因此无法检出早期的MPM 患者，导致了MPM 患者的预后较差〔5〕。因此，探索MPM 的发病机制，寻找辅助早期诊断的生物标志物，对于提高患者的生存率至关重要。

血小板反应蛋白（thrombospondin，THBS）又称凝血酶敏感蛋白，其家族由THBS1、THBS2、THBS3、THBS4 和THBS5 5 个成员组成，是一种具有多个结构域的钙离子相关糖蛋白〔6〕。THBS2 是由内皮细胞、免疫细胞和基质成纤维细胞产生的一种钙结合蛋白，THBS2 参与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的构建，可以与各种细胞表面受体、细胞因子、生长因子和蛋白酶相互作用〔7-8〕，广泛参与血管形成、细胞骨架的构成、细胞运动及凋亡等多种生物学进程〔9〕。目前研究发现，THBS2 基因在结直肠癌、甲状腺癌、胃癌和肝细胞癌等多种肿瘤组织和血清中高表达，并且与肿瘤进展和患者总体存活率密切相关。本研究基于多个肿瘤数据库分析MPM组织中THBS2 基因的表达水平及其与MPM 患者临床病理参数之间的关系，为MPM 的临床诊断、基因治疗及预后分析提供理论参考依据。

1 资料与方法

1.1 利用Oncomine 数据库分析基因在MPM 组织及正常组织中的表达Oncomine （ https：//www.oncomine.org）是大型肿瘤基因芯片数据库，可进行不同肿瘤及正常组织中基因的表达差异分析，同时生成可视化图谱。在Oncomine 数据库中设置搜索条件为：“Gene：THBS2”“Analysis Type：Cancer vs.Normal Analysis”“Cancer Type： Other Cancer：Mesothelioma -Pleural Malignant Mesothelioma”“SampleType：ClinicalSpecimen”，以获取Gordon等〔10〕对MPM 的相关基因芯片研究数据并进行分析。

1.2 获取TCGA 数据库中MPM 数据使用R 4.0.2 软件，利用“cgdsr”函数包从美国公共癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库（http：//tcga-adtaa.nci.nih.gov/tcga/）中下载MPM 数据集“meso_tcga_pan_can_atlas_2018”，从中获取SeqV2 代测序的mRNA 的表达结果“meso_tcga_pan_can_atlas_2018_rna_seq_v2_mrna”，将两组数据通过对应的TCGA 病例ID 进行合并和预处理，删除缺失数据。

1.3 TCGA 数据库MPM 数据集的处理及临床病理参数的相关性分析通过R 4.0.2 软件，使用“Epicalc”函数包分析MPM 数据集，其中包含87 例MPM 的样本病例。根据测序结果分析，MPM 组织样本中THBS2 基因的表达量为363.125～94 156.8，中位数为11 676.7，以该基因表达量中位数为分界点，样本THBS2 基因表达量低于中位数，定义为THBS2 低表达；反之，定义为THBS2 高表达。根据中位数分组，MPM 组织中THBS2 高表达组包含43例，低表达组包含44 例，进行临床病理参数的相关性分析。

1.4 利用UALCAN 数据库可视化分析MPM 临床病理相关性UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）是一个有效的恶性肿瘤数据在线挖掘和分析的网站，主要是基于TCGA 数据库中的相关恶性肿瘤数据提供队列数据的分析。可用于分析肿瘤和正常组织之间基因的相对转录表达，以及转录表达与临床病理参数的关联〔11〕。使用UALCAN 的“表达分析”模块和“MPM”数据集获得了THBS2 基因的表达数据。分析THBS2 基因在MPM 组织中的表达量与临床病理参数的相关性，并进行可视化分析。

1.5 THBS2 基因mRNA 表达量与MPM 患者预后的相关性使用R 4.0.2 软件“survival”和“survminer”函数包构建Kaplan-Meier 模型并进行Log-rank 法检验，探究THBS2 基因mRNA 表达水平与MPM 患者总体生存率（overall survival，OS）及无疾病进展生存率（disease-free survival，DFS）之间的关联。

1.6 THBS2 基因与其他MPM 标志物基因及THBS家族成员基因表达的相关性目前已知的MPM 肿瘤标志物分别是表皮生长因子含腓骨样胞外基质蛋白1 （epidermal growth factor containing fibulin like extracellular matrix protein 1，EFEMP1）、间皮素（mesothelin，MSLN）、钙结合蛋白2（calcium binding protein 2，CALB2）、硫酸酯酶1（sulfatase 1，SULF1）、钙粘蛋白11（cadherin 11，CDH11）和锌指蛋白FOG 家族成员2（zinc finger protein，FOG family member 2，ZFPM2）等6 种〔11〕。此外，THBS基因家族还有其他4 个基因，分别为THBS1、THBS3、THBS4 和THBS5。通 过GEPIA2 数 据 库（http：//gepia2.cancer-pku.cn/）在线检索和可视化分析THBS2 基因表达与其他基因表达的相关性。

1.7 统计分析建立MPM 患者的临床病理数据集，将患者的临床病理数据进行赋值，采用R 4.0.2软件中的函数包进行分析及绘图。正常组织和MPM组织中THBS2 基因表达水平的组间比较采用t 检验，用χ2检验及Fisher 精确概率法分析收集到的临床病理因素。生存分析使用Kaplan-Meier 模型和Log-rank 法检验。单因素和多因素分析使用COX回归模型。基因表达的相关性采用Pearson 法进行分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 THBS2 基因在正常肺组织、正常胸膜组织及MPM 组织中的表达差异通过Oncomine 数据库分析THBS2 基因在正常肺组织、正常胸膜组织及MPM 组织中的mRNA 表达。结果表明，THBS2 基因在MPM 组织中的表达均明显高于正常肺组织及正常胸膜组织，差异倍数为2.368，组间差异显著，具有统计学意义（t＝3.185，P=0.004）。见图1。

图1 THBS2 基因在MPM 组织与正常组织中的表达差异

2.2 MPM 组织中THBS2 基因mRNA 表达量与临床病理参数相关性从TCGA 数据库获取并整理得到的87 例MPM 临床资料中，患者年龄28～81岁，中位年龄64 岁；男性71 例，女性16 例，统计相关的临床病理参数。THBS2 基因mRNA 表达量与MPM 患者的年龄、性别、AJCC 分期、T 分期、N 分期、M 分期和肿瘤类型等临床病理参数之间差异均无统计学意义。见表1。

表1 THBS2 基因mRNA 表达量与临床病理参数的相关性（n=87）

2.3 MPM 组织中THBS2 表达量与临床病理参数之间的关系利用UALCAN 数据库可视化分析THBS2 基因表达量与MPM 组织中的TP53 突变、肿瘤类型、AJCC 分期、N 分期之间的相关性。结果表明，MPM 患者中THBS2 基因表达量在肿瘤N0 与N3 分期、N2 与N3 分期、N1 与N3 分期之间差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 THBS2 基因mRNA 在不同临床病理参数的MPM 组织中表达量

2.4 THBS2 基因mRNA 表达量对MPM 患者预后的影响通过R 4.0.2 软件构建Kaplan-Meier 生存模型并进行Log-rank 检验。结果表明，MPM 患者THBS2 基因mRNA 表达量对于患者的OS 有显著影响（P=0.015），THBS2 基因高表达组的中位生存时间相对于低表达组明显缩短（15.4 月vs. 24.1月）。见图3A。同时，THBS2 基因mRNA 的高表达预示着MPM 患者的DFS 较差（P=0.029），THBS2 基因mRNA 高表达组的中位生存时间相对于低表达组明显缩短（12.7 月vs.18.0 月）。见图3B。THBS2基因mRNA 的高表达预示着MPM 患者的预后不良。

图3 THBS2 基因mRNA 表达量对MPM 患者预后的影响

2.5 影响MPM 患者预后因素的单因素及多因素分析对87 例MPM 患者的临床病理信息构建COX回归模型。单因素分析结果显示，THBS2 基因表达量、肿瘤类型与MPM 患者预后之间具有显著相关性（P＜0.05），将上述有统计学意义的因素纳入多因素回归分析。多因素回归分析结果提示，THBS2 基因高表达与肿瘤类型均是影响MPM 患者预后的独立因素（P＜0.05），其中肿瘤类型为上皮样型的MPM患者预后优于非上皮样型MPM 患者（HR＜1.0）。见表2。

表2 影响MPM 患者预后的临床病理参数单因素和多因素分析

2.6 THBS2 基因与MPM 肿瘤标志物和其他THBS基因家族成员表达的相关性通过GEPIA2 数据库在线可视化分析MPM 肿瘤标志物基因EFEPM1、MSLN、CALB2、SULF1、CDH11、ZFPM2 与THBS2 基因表达的相关性。结果显示，THBS2 基因与CDH11基因的表达呈正相关（R＞0），差异有统计学意义（P＜0.01）；与CALB2 和MSLN 基因的表达呈负相关（R＜0），差异有统计学意义（P＜0.01）；与EFEMP1、SULF1 和ZFPM2 基因的表达差异无统计学意义。见图4。此外，THBS 基因家族还有其他4 个成员THBS1、THBS3、THBS4 和THBS5，对THBS2 基因与它们的基因表达也进行相关性分析。结果表明，THBS2 基因的表达与THBS1、THBS3、THBS4 基因表达呈正相关（R＞0），差异有统计学意义（P＜0.05）；与THBS5 基因表达差异无统计学意义。见图5。

图4 THBS2 基因与MPM 肿瘤标志物基因的表达相关性分析

图5 THBS2 基因与THBS 基因家族其他成员的表达相关性分析

3 讨论

MPM 是一种罕见的恶性侵袭性肿瘤，起源于胸膜腔的间皮细胞。MPM 潜伏期长、病死率高，早期无特异性临床表现，因此大多数患者被确诊时已是晚期〔12〕，后续治疗无显著疗效。MPM 早发现、早诊断和早治疗等环节的技术比较欠缺，缺乏特异性高的肿瘤生物标志物。THBS2 作为一种ECM 蛋白，参与癌症的发生发展，其与恶性肿瘤的关系一直是研究的热点。THBS2 属于由内皮细胞、免疫细胞和基质成纤维细胞分泌的基质细胞钙结合糖蛋白家族的一员，其与各种细胞表面受体、细胞因子、生长因子和蛋白酶相互作用，参与运动、趋化性、血管抑制、伤口愈合和细胞基质黏附等过程〔12〕。目前，有关THBS2 基因在多种不同类型肿瘤中的表达及作用的研究结果尚存在争议。一方面，有研究报道THBS2 基因在非小细胞肺癌〔13〕、胰腺癌〔14-15〕、结直肠癌〔16〕等肿瘤中显著高表达。另一方面，还有研究报道THBS2 基因在胃癌〔17-18〕、宫颈癌〔19〕、乳腺癌〔20〕等肿瘤中呈现显著低表达。THBS2 基因表达与MPM 发生发展的关系鲜见报道。本研究主要基于多个肿瘤数据库进行数据挖掘，通过R 软件进行统计分析，探讨THBS2 基因表达量与MPM 患者临床病理参数相关性及其预后意义，并与已发现的MPM 肿瘤标志物基因进行基因表达相关性分析。研究结果显示，相较于正常肺组织和胸膜组织，在MPM 组织中THBS2 基因的表达量呈现显著增高，结果提示THBS2 可能是与MPM 发生发展相关的一个癌基因。通过构建Kaplan-Meier 生存分析结果显示，THBS2 基因的表达量与MPM 患者的预后负相关，THBS2 基因高表达的MPM 患者OS 和DFS均显著降低。通过构建COX 回归模型，结果提示THBS2 基因高表达及非上皮样型MPM 是独立的危险因素，导致MPM 患者的预后不良。综上所述，THBS2 基因有望作为MPM 的诊断基因，通过检测患者体内THBS2 基因的表达水平，协助临床的早期诊断和预后判断。有研究指出，根据MPM 患者的不同临床病理分型，上皮样型的MPM 患者约占所有MPM 患者的80%，且上皮样型患者的预后明显优于双相混合型及肉瘤型患者〔21-22〕，这与本研究结果完全一致。结合其他文献的报道〔11〕，本研究发现MPM 肿瘤标志物CDH11 基因与THBS2 基因的表达呈显著正相关，CALB2 和MSLN 基因与THBS2基因的表达呈显著负相关。此外，THBS 基因家族3个成员THBS1、THBS3、THBS4 的表达与THBS2 基因的表达均呈显著正相关。以上结果提示，MPM 的发生和进展过程较为复杂，是一个多基因共同作用的结果。因此，探索MPM 的发病机制，研究基因表达量与MPM 患者临床病理特征的相关性，改善MPM患者的预后仍是今后临床研究需要探索的方向。

本研究基于肿瘤数据库进行生物信息学分析，样本量相对较大，可信度较高，有一定的参考价值，但是本研究仅局限于mRNA 水平上的研究，缺乏蛋白质水平检测。在后续研究中，可通过在临床中采集MPM 样本，利用免疫组化和蛋白质印迹法等实验探明THBS2 在MPM 组织中的蛋白质表达水平。同时通过体外实验，构建敲低或过表达THBS2 基因的细胞模型，进一步验证其对MPM 细胞生长、增殖和凋亡的影响，或者通过药物实验，探索和制备THBS2 的小分子抑制剂和单克隆抗体，以期对MPM的临床诊疗及预后评估提供潜在的新基因靶标。