卵巢肿瘤去泛素化酶7A基因与鹅肥肝形成关系的研究

孙青云，范 翔，邢 娅，赵敏孟，刘 龙，耿拓宇，龚道清

（扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009）

鹅肝是具有较高经济价值的产品，经填饲后鹅肝可以增大8～10倍而不发生明显的病理症状[1]，而人体肝脏脂肪聚集过多则会导致脂肪肝，易发展为非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化甚至肝癌，这表明鹅肝脏中存在着某种脂肪耐受机制[2]。以往研究表明，鹅肥肝具有一些不同于哺乳动物脂肪肝疾病的特点，如鹅肥肝中脂肪酸去饱和酶升高及内质网应激基因表达下降[3]、脂联素受体基因表达增加[4]、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达减少[5]、线粒体相关基因表达增加[6]和补体基因表达被抑制[7]等。非酒精性脂肪肝（NAFLD）通常与高血糖、高胰岛素血症和高血脂有关，作者所在研究团队前期研究发现，脂肪肝形成相关因子葡萄糖、胰岛素、油酸、亚油酸、棕榈酸等对鹅肥肝中胰岛素样生长因子结合蛋白2、己糖激酶基因的表达有一定调控作用[8-9]。王倩[9]报道，较高浓度的葡萄糖和饱和脂肪酸可诱导鹅原代肝细胞中己糖激酶1（HK1）基因的表达，而较高浓度的胰岛素和不饱和脂肪酸可抑制鹅原代肝细胞中HK1基因的表达。目前，鹅肥肝形成中的脂肪耐受机制尚不完全明确，对其进行研究有助于揭示鹅肥肝的形成机理，也可为其他畜禽和人类脂肪肝的研究提供参考。

卵巢肿瘤去泛素化酶7A（OTUD7A）又名细胞锌指结构抗NF-κB 2（CEZANNE）酶,属于卵巢肿瘤去泛素化酶家族的成员之一，该家族成员参与核因子κB（NF-κB）信号通路、干扰素信号通路和p97介导过程等多条信号通路的调控[10]。对哺乳动物的研究发现，肝脏组织的炎症反应是肝脏从脂肪变性发展为肝炎的重要生理过程[11]。NF-κB通路是其中关键促炎信号途径[12]。据报道，OTUD7A基因可通过调控靶蛋白去泛素化，抑制NF-κB信号通路，进而在抑制炎症反应中发挥作用[10，13]。因此，推测OTUD7A基因可能参与鹅肥肝的形成。但目前OTUD7A基因在鹅肥肝形成中的生理功能尚不清楚。本试验主要应用实时荧光定量PCR技术测定不同填饲阶段朗德鹅肝脏中OTUD7A基因的表达水平，以及不同浓度葡萄糖、胰岛素及脂肪酸处理对鹅原代肝细胞中OTUD7A基因表达水平的影响；利用转录组测序技术分析在鹅原代肝细胞中转染OTUD7A过表达载体对细胞功能的影响，旨在探索OTUD7A基因在脂肪肝形成中的作用，也为阐明鹅肥肝形成的机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 Trizol Universal总RNA提取试剂盒、快速质粒小提试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；HisScriptTMQ RT SuperMix for qPCR反转录试剂盒、Vazyme AceQTMqPCR SYBR Green Master Mix试剂盒均购自诺唯赞生物有限公司；DMEM高糖培养基、DMEM低糖培养基、Opti-MEM培养基、胎牛血清（FBS）均购自Gibco公司；青霉素-链霉素购自上海碧云天生物技术研究所；PBSC10010（pH 7.4）购自扬州必帮生物技术有限公司；红细胞裂解液、DMSO、葡萄糖均购自Solarbio公司；表皮生长因子（EGF）购自PEPROTECH公司；Ⅳ型胶原酶购自Worthington公司；胰岛素、油酸钠、棕榈酸钾均购自Sigma公司；Lip2000 Transfection Reagent购自Biosharp公司；pcDNA3.1-OTUD7A载体、空载体均购自苏州吉玛生物科技有限公司；氯化钠、氯仿、异丙醇、无水乙醇等其他试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 试验动物 试验用朗德鹅由淮安笠诚畜禽养殖公司提供。 选取同批孵化、相同饲养条件下体重一致（3.6～3.8 kg）的70日龄朗德鹅公鹅40只。

1.2 方法

1.2.1 朗德鹅分组及处理 40只朗德鹅公鹅随机分为对照组和试验组（填饲组），每组20只。填饲饲料配制：将玉米颗粒倒入锅中煮沸5 min后取出沥干，加入1%植物油和1%食盐，每10 kg玉米添加20 g复合维生素，充分搅拌均匀后立即填饲。玉米购自吉林德惠；复合维生素购自扬大饲料厂（每g复合维生素组成：维生素A 5 000 IU，维生素D 1 000 IU，维生素E 7.50 IU，维生素K 0.75 mg，维生素B1 1 mg，维生素B2 2 mg，维生素B6 1.50 mg，维生素B12 0.01 mg，烟酸 30 mg，泛酸 6 mg，叶酸 0.25 mg，生物素 0.10 mg）。填饲方法参考Osman等[14]方法进行，填饲饲料现用现配。填饲的第1～5天每日采食量为500 g，每天分3次进行填饲；填饲第6～12天每日采食量为800 g，每天分4次进行填饲；填饲第13～19天每日采食量为1 200 g，每天分5次进行填饲。对照组饲喂同样的饲料，自由采食，每天每只鹅采食120～130 g。填饲第7、14、19天时，从对照组和填饲组随机选取6只鹅屠宰。取肝脏样品装入1.5 mL RNase-free冻存管中，液氮浸泡后于-80 ℃保存，用于OTUD7A基因mRNA表达水平的测定。

1.2.2 鹅原代肝细胞的分离培养 试验选用孵化23胚龄的朗德鹅鹅蛋，采用1 mg/mL Ⅳ型胶原酶消化分离鹅原代肝细胞，分离后肝细胞的培养参照洪胜辉等[15]方法进行。按6×105/孔的密度进行接种，并转移至37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养；培养6 h后，用PBS漂洗以去除未贴壁细胞，更换新的DMEM完全培养基（100 mL DMEM基础培养液中加入10 mL FBS、1 mL青霉素-链霉素混合液（100 IU/mL）、20 μL EGF工作液（20 ng/mL）），于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养。

1.2.3 脂肪肝形成相关因子处理鹅原代肝细胞 脂肪肝形成相关因子处理浓度参考Osman等[14]。当鹅原代肝细胞生长汇合度达70%时，分别用含0（空白组）、125、250 mmol/L葡萄糖溶液，0（空白组）、50、100、200 nmol/L胰岛素溶液，0（空白组）、0.125、0.250 mmol/L油酸、亚油酸溶液，0（空白组）、0.25、0.50 mmol/L棕榈酸的DMEM完善培养基处理鹅原代肝细胞，每个处理组6个重复。各组细胞添加相应培养液后，放入CO2培养箱中培养24 h，收集细胞备用。

1.2.4 RNA提取、cDNA合成及实时荧光定量PCR检测 用Trizol法提取朗德鹅肝脏及鹅原代肝细胞RNA，反转录合成cDNA。根据GenBank中OTUD7A基因序列（登录号：NC_030817.1）用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物信息见表1。以GAPDH为内参基因，进行实时荧光定量PCR。PCR反应体系20 μL：SYBR®Premix ExTaq（2×） 10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ （50×） 0.4 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。目的基因表达水平用2-ΔΔCt法进行计算。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.5OTUD7A基因过表达载体构建及转录组学测序

1.2.5.1OTUD7A基因过表达载体构建及验证 由苏州吉玛生物科技有限公司合成过表达载体pcDNA3.1-OTUD7A，用PCR方法得到OTUD7A基因序列片段，分别酶切OTUD7A基因与pcDNA3.1载体，并对纯化后产物进行连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对形成的克隆先进行酶切鉴定，证明目的基因已经定向连入目的载体。对阳性克隆进行测序和分析比对，比对正确的即为构建成功的目的基因表达质粒载体。将构建好的重组载体进行超纯抽提得到pcDNA3.1-OTUD7A载体。按照快速质粒小提试剂盒说明书进行过表达载体质粒提取操作。待鹅原代肝细胞生长汇合度达70%时，按照Lip2000（biosharp）说明书进行转染试验。转染6 h后，用预热的PBS清洗3遍，更换为DMEM完全培养基，在37 ℃的细胞培养箱中继续培养24 h后收集细胞，按照1.2.4的方法进行RNA提取、反转录并用实时荧光定量PCR验证过表达是否成功。

1.2.5.2 转录组学测序 将空载体（pcDNA3.1）转染组和过表达OTUD7A基因的鹅原代肝细胞进行RNA-Seq分析。RNA-Seq由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。对测序数据进行过滤后，通过Bowtie2建立参考基因组索引，使用Tophat2软件将过滤后的Reads与参考基因组进行对比分析。 其中参考基因组为：鸿雁（登录号：AnsCyg_PRJNA183603_v1.0），得到的Mapping比例为53.55%～61.80%。 采用DESeq R包（1.18.0）进行差异表达基因分析，其筛选条件为：表达差异倍数|log2FoldChange|>1，P<0.05表示差异显著。P值使用Benjamini和Hochberg方法进行校正。使用GOseq软件（Release2.12）进行GO功能富集分析。先将全部基因映射到GO数据库的条目，计算各个条目的差异表达基因数目，再以整个基因组为背景，用超几何分布计算差异表达基因显著富集的条目。

1.3 数据统计与分析

用SPSS 16.0软件采用t检验进行差异显著性分析，结果用平均值±标准误表示。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 填饲对朗德鹅肝脏中OTUD7A基因表达的影响

由图1可知，在填饲第7和14天时，填饲组鹅肝脏中OTUD7A基因的表达显著高于对照组（P<0.05）。而在填饲第19天时，填饲组鹅肝脏中OTUD7A基因的表达极显著低于对照组（P<0.01）。

*，差异显著（P<0.05）；**，差异极显著（P<0.01）。图3同*,Significant difference （P<0.05）；**，Extremely significant difference （P<0.01）.The same as fig.3图1 朗德鹅肝脏中OTUD7A mRNA的相对表达水平Fig.1 The relative expression level of OTUD7A mRNA in Landes goose liver

2.2 脂肪肝形成相关因子对OTUD7A基因表达的影响

由图2可知，与空白组相比，125 mmol/L葡萄糖处理对鹅原代肝细胞中OTUD7A基因的表达无显著影响（P>0.05），但250 mmol/L葡萄糖处理显著提高了细胞中OTUD7A基因的表达水平（P<0.05）；不同浓度的胰岛素、油酸、亚油酸处理鹅原代肝细胞后，各组间OTUD7A基因的表达水平均无显著差异（P>0.05）；与空白组相比，0.25和0.50 mmol/L棕榈酸处理均显著提高OTUD7A基因的表达水平（P<0.05）。

肩标不同字母表示差异显著（P<0.05）；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著（P>0.05）Values with different letter superscripts mean significant difference （P<0.05）; While with the same or no letter superscripts mean no significant difference （P>0.05）图2 脂肪肝形成相关因子对鹅原代肝细胞中OTUD7A mRNA表达水平的影响Fig.2 Effects of fatty liver formation related factors on OTUD7A mRNA expression level in goose primary hepatocytes

2.3 OTUD7A基因过表达载体的验证

由图3可知，与空载体组相比，过表达组OTUD7A基因mRNA水平的表达量极显著提高（P<0.01）,故pcDNA3.1-OTUD7A过表达载体构建成功。

图3 过表达后鹅原代肝细胞中OTUD7A mRNA的表达水平Fig.3 Expression level of OTUD7A mRNA in goose primary hepatocytes after overexpression

2.4 OTUD7A基因过表达后差异表达基因GO功能富集分析

转录组测序结果表明，与空载体组相比，OTUD7A基因过表达后共筛选到34个差异表达基因，其中有19个基因表达上调、15个基因表达下调。对差异表达基因进行GO功能富集分析发现，这些差异表达基因被注释到165条GO条目中。其中，100条被注释到生物过程（biological process），31条被注释到细胞组分（cellular component），34条被注释到分子功能（molecular function）。

由表2可知，生物过程差异表达基因主要富集在对微生物的防御反应（defense response to other organism）、对外界生物刺激的反应（response to external biotic stimulus）、对微生物的反应（response to other organism）、T细胞分化（T cell differentiation）等；在细胞组分方面，差异表达基因主要富集在细胞外区域部分（extracellular region part）、细胞质（cytoplasm）、非包膜细胞器（non-membrane-bounded organelle）、细胞外外泌体（extracellular exosome）、细胞骨架（cytoskeletal part）；而在分子功能方面，差异表达基因则主要富集在GTP酶活性（GTPase activity）、水解酶活性（hydrolase activity）、核苷三磷酸酶活性（nucleoside-triphosphatase activity）、肽酶活性（peptidase activity）、催化活性（catalytic activity）等。 其中，CLMP、PROCR、SH3BP1、ARHGAP28、ACE、OTUD7A、LOC106045877、LOC106048002基因的表达上调，TNFSF8、DDX60、PLAC8、RSAD2、MX1、RSAD2、GBP1基因的表达下调。

表2 OTUD7A基因过表达后差异表达基因GO功能富集分析Table 2 GO function enrichment analysis of differentially expressed genes after OTUD7A gene overexpression

3 讨 论

本研究前期数据表明，填饲7、14、19 d后，填饲组朗德鹅肝脏重量分别从填饲前的86.45、92.90、80.63 g增加到填饲后的182.76、416.00和826.00 g[16]，证明鹅肥肝模型建立成功。人肝癌细胞试验发现，OTUD7A基因可以通过对肿瘤坏死因子受体相关分子6（TRAF6）基因进行去泛素化调节，起到抑制NF-κB通路的作用[13]。研究表明，通过抑制NF-κB通路，可降低肝脏中炎症因子（如TNF-α）的表达，缓解NAFLD的发展[17]。本研究结果发现,在填饲第7和14天时，填饲组鹅肝脏中OTUD7A基因的表达量显著高于对照组，表明短期填饲可以促进鹅肥肝中OTUD7A基因的高表达，而OTUD7A表达增高可能抑制鹅肥肝中炎症的发生。

哺乳动物NAFLD的形成常伴随着高血糖症、高血脂症和高胰岛素血症[18-19]。据报道，鹅肥肝形成过程中也出现了葡萄糖、胰岛素和脂肪酸升高等现象[20-21]。本研究结果表明，250 mmol/L葡萄糖及0.25和0.50 mmol/L的棕榈酸处理均显著提高OTUD7A基因的表达水平，说明高浓度葡萄糖和低浓度棕榈酸（饱和脂肪酸）可以诱导鹅肝细胞中OTUD7A基因的表达。用油酸（单不饱和脂肪酸）和亚油酸（多不饱和脂肪酸）处理肝细胞后对OTUD7A基因的表达无显著变化，与棕榈酸的处理结果并不相同，这可能是因为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸具有的不同生物学效应。杨彪[4]研究发现，在鹅原代肝细胞中，葡萄糖和油酸提高了脂联素受体2（Adipor2）的表达，胰岛素抑制Adipor2基因的表达，而棕榈酸对其表达无显著影响。可见，当用不同因子处理鹅肝细胞后，不同基因的表达情况不尽相同，可能与这些因子激活不同的信号通路和转录因子有关。

GO功能富集分析发现，差异表达基因主要富集在对其他生物的防御反应、对外界生物刺激的反应、T细胞分化和外泌体等条目。 研究发现，NAFLD患者脂肪肝的严重程度与T细胞亚群的变化有关，当脂肪肝的严重程度增加时，CD8+T细胞数量逐渐下降，CD4+T细胞数量逐渐升高，而增加的CD4+T细胞可通过TNF-α、白细胞介素-1β（IL-1β）的产生参与NAFLD的发生与发展[22]。外泌体作为介导细胞间信号传递的载体，可调节肝细胞与炎症细胞间的信号交流及物质传递，影响单核巨噬系统的活性，起到调节肝脏炎症反应的作用。Ibrahim等[23]研究发现，棕榈酸能激活肝细胞的混合谱系激酶3，使肝细胞释放出含有趋化因子配体10（CXCLl0）的外泌体，进而调节巨噬细胞的活化，加速肝脏损伤。因此，OTUD7A基因可能通过调控对其他生物的防御反应、对外界生物刺激的反应、T细胞分化和外泌体等条目相关基因的表达参与鹅肥肝的形成。

肿瘤坏死因子超家族成员（TNFSF）是由免疫细胞分泌的具有多种生物学效应的细胞因子，TNFSF及其膜受体（TNF-R）相互作用参与调控细胞生长与凋亡、机体炎性反应和免疫应答等[24]。据报道，TNFSF8和其受体TNFRSF8结合后，TNFRSF8通过与TRAF蛋白结合，激活NF-κB信号通路，从而可介导白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素6（IL-6）、TNF-α等细胞因子的分泌[25-26]。转录组学结果表明，在鹅原代肝细胞中过表达OTUD7A基因可抑制TNFSF8基因的表达，提示鹅肝脏TNFSF8基因的表达可能受到OTUD7A基因的调控，且OTUD7A基因有可能通过调控TNFSF8基因参与鹅肥肝形成中的炎症反应。

自由基S-腺苷蛋氨酸结构域2（RSAD2）是一种抗病毒蛋白，可被干扰素诱导表达[27]。此外，RSAD2还有一些其他的生物学功能，Qiu等[28]研究发现，RSAD2在NF-κB活性的调节和CD4细胞的分化发育中具有重要作用，在RSAD2基因敲除小鼠中，表现出NF-κB活性的降低，导致细胞因子包括白细胞介素4（IL-4）、白细胞介素5（IL-5）和白细胞介素13（IL-13）的表达水平降低。抗黏液病毒1（MX1）蛋白是Ⅰ型干扰素诱导产生的一类活性蛋白质，在固有免疫反应中发挥重要功能[29]。鸟苷酸结合蛋白1（GBP1）在抗病原微生物中发挥重要作用，α干扰素（IFN-α）、β干扰素（IFN-β）和γ干扰素（IFN-γ）均能够诱导GBP1的表达[30]。本试验结果表明，在鹅原代肝细胞中过表达OTUD7A基因后，RSAD2、MX1和GBP1基因表达水平均显著下调，推测鹅肝脏中RSAD2、MX1和GBP1基因的表达可能受到OTUD7A基因的调控。而RSAD2、MX1和GBP1作为与免疫相关的基因，可能与鹅肝脏中抑制炎症发生过程相关。

CLMP被认为是脂肪细胞黏附分子（ACAM），在啮齿动物和肥胖人类的成熟脂肪细胞中上调。在喂食高脂肪、高蔗糖（HFHS）食物的ACAMTg小鼠中，ACAM在成熟脂肪细胞的质膜上大量表达，其中形成了小带黏附样结构[31]。小带黏附的形成可以增加机械强度，抑制脂肪细胞肥大，提高胰岛素敏感性。蛋白C受体（PROCR）是Th17致病性的负调控因子，下调多个致病特征基因的表达，包括IL-1和IL-23受体[32]。本研究转录组测序结果显示，在鹅原代肝细胞中过表达OTUD7A基因可使CLMP和PROCR基因的表达上调，说明OTUD7A基因可能通过调控CLMP和PROCR基因参与鹅肥肝的形成过程。

4 结 论

综上所述，在朗德鹅填饲前期OTUD7A基因的表达显著上调；250 mmol/L葡萄糖和0.25、0.50 mmol/L棕榈酸处理能显著诱导鹅原代肝细胞中OTUD7A基因的表达，OTUD7A基因通过参与调控TNFSF8、RSAD2、MX1、GBP1、CLMP和PROCR等基因的表达参与鹅肥肝的形成。