全自动微生物分析仪在临床儿科肺炎链球菌药敏试验中的应用

文/邓起秀

肺炎链球菌是小儿肺炎、菌血症、脑膜炎等诸多细菌感染疾病的主要病原菌之一，相关数据表明，全球5岁以下儿童中每年约有70～100万死于肺炎链球菌性疾病。因此，加强对肺炎链球菌的抗菌药物敏感性试验，早期采取针对性的抗菌药物治疗方案尤为重要。但有研究指出，不同的抗菌药物敏感性试验方法可取得不同的检测结果。E-test法在临床上较为常见，可取得较高的准确性。随着检验技术的不断发展，全自动微生物分析仪因其具有检测快速、操作简便、检测准确等优势在临床中得到广泛应用。基于上述背景，本文将2021年7月至2021年11月本院儿科分离的30株肺炎链球菌作为研究对象，其中将青霉素用郑州安图E-test法与国产珠海迪尔细菌测定系统（DL-96Ⅱ）进行对比，其他抗菌药物敏感性试验用温州康泰药敏纸片（K-B法）与国产珠海迪尔细菌测定系统（DL-96Ⅱ）进行对比，观察检测结果，旨在探索一种简便、快速、有效的检验方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机抽取2021年7月至2021年11月本院分离的肺炎链球菌30株进行研究，均来源于儿科患儿的痰液、鼻腔分泌物等标本（同一患儿同一标本类型，不重复计入）。对应的患儿信息为男23例，女7例；年龄1个月～6岁，平均（3.15±0.92）岁，其中1个月～1岁27例，1～3岁2例，3～5岁1例；肺炎2例，鼻窦炎1例，急性咽炎1例，支气管肺炎26例；咳嗽14例，咳痰5例，喘息1例，气促2例，发热8例。

1.2 方法

试剂与仪器：K-B法药敏纸片（温州康泰），青霉素E-test纸条（郑州安图）、血琼脂平板、5%绵羊血MHA平板（郑州安图），麦氏标准比浊管、药敏稀释液、药敏指示剂、样本稀释液、细菌鉴定药敏鉴定板（珠海迪尔生物工程）。

（1）细菌分离鉴定：将标本接种于血琼脂平板中，放置于5%CO、35℃培养箱中培养18～24h，经典型菌落形态观察，挑选血平板上草绿色溶血、脐窝状的可疑菌落做进一步分纯，同时采用药敏纸片进行奥普托欣敏感性试验，再用国产珠海迪尔细菌测定系统（DL-96Ⅱ）鉴定为肺炎链球菌。

（2）抗菌药物敏感性试验：采用苛养菌5%绵羊血MHA平板以K-B法复核药敏结果，其中青霉素采用E-test方法，同时也用国产珠海迪尔细菌测定系统（DL-96Ⅱ）进行抗菌药物敏感性试验。

（3）具体操作方法：

①K-B法：严格按照第四版《全国临床检验操作规程》进行，选取血琼脂平板上菌落配置0.5麦氏浊度菌悬液，用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，挤出过多菌液，在5%绵羊血MHA平板表面反复均匀涂抹3次，每涂抹一次旋转平板60°，最后沿平板内缘涂两圈，待琼脂表面菌液干燥，在15～20min内用无菌镊子将纸片贴于平板表面，各纸片中心距离不小于24mm，并确保纸片与平板表面完全接触，放置于35℃、5%CO培养箱中培养20～24h后测量抑菌圈直径。

②青霉素E-test方法：前述步骤与K-B法一致，待琼脂表面菌液干燥用无菌镊子将E试条贴于平板表面，确保整个药敏条与琼脂表面完全接触，放置于35℃、5%的CO培养箱中孵育20～24h后读取结果。

③微量肉汤稀释法（参考方法）：取纯培养单个菌落于稀释液瓶内壁研磨呈细菌悬液（2麦氏），用连续移液器吸取该菌悬液加入试剂板A5-A12孔内，每孔100μL，吸菌悬液500μL，加至增菌肉汤培养基中，充分混匀，继续加入试剂板A1-A4、B1-B7孔内，每孔100μL，在A1-A4、A9、B1-B7孔分别滴加无菌液状石蜡两滴；再吸剩余增菌肉汤培养基50μL，加至药敏培养基，充分混匀，继续加入试剂板其余各孔（所有的抗菌药物MIC测定试验孔、生长对照空及6.5%NACL），每孔100μL，并在C1孔滴加无菌液状石蜡2滴；封板然后放培养箱35℃18～24h后上机读取结果。

（4）质量控制：质控菌株为肺炎链球菌ATCC49619，其药敏结果必须符合质控范围。

1.3 观察指标

（1）检测结果：3种方法均根据CLSIM100第30版规定的折点判断标准进行检测结果分析，主要分为3级：敏感（S）、中介（I）、耐药（R）。（2）青霉素以E-test法进行实验，其他药物以K-B法进行实验，均经国产珠海迪尔细菌测定系统（DL-96Ⅱ）复核。参照上述CLSI规定的折点判断标准，分析检验结果：①分类符合（CA），国产珠海迪尔细菌测定系统（DL-96Ⅱ）S、I、R结果与E-test法/K-B法检验结果一致；②非常重大误差（VME），国产珠海迪尔细菌测定系统（DL-96Ⅱ）将R误判为S；③重大误差（ME），国产珠海迪尔细菌测定系统（DL-96Ⅱ）将S判定为R；④一般误差（mE），E-test法/K-B法检验结果为S或R，而国产珠海迪尔细菌测定系统（DL-96Ⅱ）结果为I或E-test法/K-B法检验结果为I，而国产珠海迪尔细菌测定系统（DL-96Ⅱ）结果为S或R。可接受的误差范围：CA≥90%，VME≤1.5%，ME≤3%，mE≤10%。

2 结果

2.1 检测结果分析

根据CLSI折点判定标准，珠海迪尔细菌测定系统（DL-96Ⅱ）与E-test法/K-B法的S、I、R结果如表1所示。

表1 检测结果分析

2.2 两种检测方法比较

青霉素以E-test检验结果为参考，其他抗菌药物以K-B法复核，国产珠海迪尔细菌测定系统（DL-96Ⅱ）对青霉素、万古霉素、左氧氟沙星、利福平、利奈唑胺、四环素的CA均为100.00%；对复方新诺明的CA为93.33%，ME为6.67%；对红霉素、克林霉素的CA均为93.33%，mE均为6.67%。具体结果如表2所示。

表2 两种实验方法比较［n=30，例（%）］

3 讨论

肺炎链球菌是儿童呼吸道感染的主要致病菌之一，也是大叶性肺炎的病原菌，还可伴有菌血症。肺炎链球菌属条件致病菌，正常情况下定植于鼻咽部，当机体免疫功能失衡时，可引起鼻窦炎、中耳炎等非侵袭性疾病；若细菌入血，还可引起骨髓炎、菌血症、败血症等，对患儿的生命安全造成威胁。随着青霉素的广泛应用，细菌耐药性的问题日益突出，引起多重耐药菌株，显著增加临床治疗难度。有研究通过对某地区患儿的侵袭性肺炎链球菌病患儿进行分析发现，死亡病例的分离菌株多为多重耐药菌株，故认为多重耐药与患儿的不良预后有一定的联系；同时青霉素不敏感患儿合并基础疾病、罹患脑膜炎、合并多种耐药的概率依次为30.7%、32.0%、86.7%，均高于青霉素敏感肺炎链球菌患儿的15.4%、9.2%、63.1%。由此可见，青霉素引起的耐药问题会对患儿的临床预后产生不良影响，故选择一种有效、安全的抗菌药物尤为重要。王传清等于2016年对10家儿童医院进行监测，结果发现肺炎链球菌是我国儿童临床优势分离株，且儿童的分离比例明显高于成人；而肺炎链球菌青霉素不敏感株占比从0.9%到71%不等，提示细菌耐药问题形势严峻。

抗菌药物敏感性试验，简称药敏试验，是指在体外测定抗菌药物抑制或杀灭微生物的能力，能够为临床治疗选择准确的抗菌药物，常见的检验方法包括肉汤稀释法、E-tset法、纸片扩散法等。抗菌药物敏感性试验，能够针对菌株选择敏感性抗菌药物，最大化确保抗感染治疗效果，对于患儿的临床治疗及预后具有重要意义。根据CLSI相关规定，头孢曲松、美罗培南等均可用于肺炎链球菌感染的治疗，但针对上述药物尚无可靠的K-B法进行抗菌药物敏感性试验，故建议应采用MIC法进行确定。全自动微生物分析仪是目前国内临床广泛应用的抗菌药物敏感性试验方法，其中国产珠海迪尔细菌测定系统（DL-96Ⅱ）能够测得青霉素、复方新诺明、四环素、红霉素、克林霉素、利福平、万古霉素等多种抗菌药物的MIC值。该分析仪的检验原理检测系统由生化反应孔和抗菌药物MIC测定试验孔组成，在生化反应孔加入细菌悬液，抗菌药物MIC测定试验孔中加入培养基，经35℃～37℃孵育。生化反应在细菌代谢作用下直接产生颜色变化或经加入显色剂后产生颜色变化，抗菌药物MIC测定试验根据试验孔是否出现浑浊（沉淀）确定细菌是否生长，通过细菌测定系统分析从而将细菌快速、准确地鉴定到种属，同时分析抗菌药物的MIC值。本研究将青霉素以E-test法进行试验，其他药物以K-B法进行试验，结果显示该分析仪对青霉素、万古霉素、左氧氟沙星、利福平、利奈唑胺、四环素的CA均为100.00%，提示国产珠海迪尔测定系统（DL-96Ⅱ）在上述6种抗菌药物药敏性试验中与E-test法/K-B法具有高度一致性。分析仪对复方新诺明、红霉素、克林霉素的CA均为93.33%，＞90%，提示符合率在标准范围内。在误差结果分析方面，发现分析仪对红霉素、克林霉素的mE均为6.67%，符合≤10%的标准，提示误差在可接受范围内；但对复方新诺明的ME为6.67%，不符合≤3%的标准，提示误差在不可接受范围内。由此可见，对于肺炎链球菌，国产珠海迪尔测定系统检（DL-96Ⅱ）测复方新诺明的药敏试验不可靠，需进行进一步验证。但综合研究结果可知，国产珠海迪尔测定系统（DL-96Ⅱ）可检出肺炎链球菌对多种抗菌药物的敏感性，且与K-B法相比存在较高的一致性，证实该分析仪在肺炎链球菌中抗菌药物敏性试验中的应用价值。黄梅等研究中还指出，全自动微生物分析仪检验快速、重复性高，可显著提升工作效率，且受到人为因素的影响较小，检验结果具有较高的准确性。

综上所述，全自动微生物分析仪具有检验准确、操作简便、快速、受人为因素影响小、重复性高、精确检测细菌的MIC浓度、结果符合率高等特点，可检出儿科肺炎链球菌对大部分抗菌药物的敏感性，但在复方新诺明的敏感试验中尚存在一定的局限性，还需做进一步验证。