香连外洗液对氟康唑抗耐药白念珠菌增效作用的转录组学研究*

王 平 范瑞强 柏彩英

近年来，随着广谱抗生素、激素等在临床的广泛使用，侵入性检查和治疗手段的广泛开展，由白念珠菌导致的真菌感染性疾病不断出现。究其原因，白念菌株对唑类药物如氟康唑(Fluconazole，FCZ)可稳定遗传的耐药性是这一治疗瓶颈的主要原因。从天然化合物中发现可以增强现有抗真菌药物敏感性的药物应用于临床，是解决这一困境的可行之路。实验研究和临床实践都证实[1-3]，由广东省中医院范瑞强教授的经验方制成的香连外洗液具有抗菌、增效作用。

本研究就香连外洗液对氟康唑抗耐药菌株的增效作用进行研究，并采用转录组测序的方法，对差异基因进行分析，为进一步研究香连外洗液对氟康唑抗耐药菌株的增效机制打下基础。

1 材料

1.1 药物氟康唑原药粉末：购自华迈科生物科技有限公司，有效期2022年12月，纯度99%。香连外洗液：含生药浓度100%，120 ml/瓶，批号190921，批准文号：粤药制字Z20071446，原液浓度为1000 mg/ml，有效期至2020年9月18日

1.2 菌株克柔念珠菌ATCC6258、白念珠菌ATCC10231 (由广东省中医院赠送)。其中，ATCC6258为质控菌株。

1.3 培养基96孔板、SDA平板(均购自广东省广州市威佳科技有限公司)、RPM1640培养基(购自广东省江门市凯琳贸易有限公司)。

1.4 仪器天根多酚试剂盒(TIANGEN公司)、Touch q-PCR System CFX96(BIO-RAD公司)、Novaseq 6000测序平台(Illumina公司)等。

2 方法

2.1 质量控制以克柔念珠菌ATCC6258为质量控制菌株按照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的M27-A3方案，进行MIC值的判定。

2.2 氟康唑 香连外洗液对白念珠菌ATCC10231MIC值的测定采用微量液基稀释法测定单一使用香连外洗液或氟康唑时，对白念珠菌ATCC10231的MIC。

2.3 氟康唑与香连外洗液联合抗菌作用的研究采用棋盘微量稀释法观察氟康唑与香连外洗液的联合抗菌作用。联合应用的效果通过计算抑菌浓度分数指数(Fractional Inhibitory Concentration Index，FICI)来确定。

2.4 结果判定按照CLSI的M27-A3方案进行。

2.5 白念珠菌总RNA的提取采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取白念珠菌的总RNA样品。浓度、纯度的检测采用NanoPhotometer Spectrophotometer进行。完整性的检测采用Agilent 2100 Bioanalyzer进行。

2.6 转录组测序及生物信息学分析通过Oligo(dT)磁珠富集带有polyA尾mRNA。之后，以被打断的、片段化的mRNA为模版，合成cDNA第一条链，随后以dNTPs为原料合成cDNA第二条链。纯化后的双链cDNA经过末端修复、加A尾并连接测序接头，最终获得文库。文库构建完成后，进行定量，并对文库的insert size进行检测。库检合格后，采用Novaseq 6000测序平台进行测序，获得主要包含测序片段的序列信息以及其对应的测序质量信息fastq格式文件。对原始数据进行过滤后，得到clean reads，并对clean data进行Q20、Q30和GC含量计算。从基因组网站下载参考基因组和基因模型注释文件，采用HISAT2 V 2.0.5进行与参考基因组的比对及分析；根据基因的长度计算每个基因的FPKM，并计算映射到该基因的读数。根据基因的表达量(FPKM)再计算该基因的差异表达倍数。对差异基因的分析采用edgeR(Robinson et al, 2010)进行，以表达倍数差异log2|fold change|>0，显著性p-value<0.05作为筛选条件。差异基因GO富集分析和KEGG分析通过ClusterProfiler(3.4.4)软件进行。

3 结果

3.1 香连外洗液 氟康唑对ATCC10231的MIC香连外洗液、氟康唑对白念珠菌ATCC10231的MIC值分别为15.63 mg/ml、64 μg/ml，表明菌株ATCC10231为氟康唑耐药株。

3.2 氟康唑与香连外洗液联合抗菌作用的研究联合使用时，香连外洗液、氟康唑对白念珠菌ATCC10231的MIC值分别为3.906 mg/ml、4 μg/ml。据计算得出，FICI值为0.31，表明氟康唑与香连外洗液对耐药白念珠菌ATCC10231有联合抗菌作用。

3.3 白念珠菌ATCC10231总RNA提取的结果经NanoPhotometer、Spectrophotometer检测，2种不同处理后， ATCC10231总RNA的浓度分别为754 ng/μl、1576 ng/μl; 经NanoPhotometer、Spectrophotometer检测，两种不同处理后，ATCC10231总RNA的OD260/280值分别为1.89、2.08，表明提取所得RNA纯度高，污染小；经Agilent 2100 Bioanalyzer检测，2种不同处理后，ATCC10231总RNA的RIN(RNA Integrity Number)值分别为7.40、8.30，表明样品总RNA完整性好。

3.4 与参考基因组比对的结果将得到的clean reads与参考基因组进行比对，2种不同处理后，ATCC10231与参考基因组的比对结果分别为：90.75%、92.02%。说明所测物种与参考基因组一致，相关实验无污染。

3.5 差异基因筛选以FPKM值作为基因表达量，进行差异基因的筛选。2种不同处理后相比较，香连外洗液+氟康唑作用后白念珠菌ATCC10231有547个基因的FPKM值的上调，963个基因的FPKM值下调。

3.6 差异基因富集分析

3.6.1 差异基因的GO分析GO分析是描述基因功能的综合性数据库，可分为生物过程(Biological Process，BP)和细胞组成(Cellular Component，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)3个部分。

2种不同处理后相比较，香连外洗液+氟康唑作用后ATCC10231差异表达基因的BP主要富集在跨膜转运、碳水化合物代谢过程、刺激应答、生物合成过程的调控、蛋白代谢过程等。这些基因的CC主要富集在细胞膜、细胞膜的组成成分、细胞膜的固有成分、膜组件、细胞器等。这些基因的MF主要富集在跨膜转运、氧化还原酶活性、ATP 结合活动、转移酶活性、水解酶活性等。

3.6.2 差异基因的KEGG分析ATCC10231差异表达基因主要富集在MFS转运蛋白家族、代谢途径、次生代谢产物的合成、糖酵解与糖异生等。

4 qRT-PCR验证基因表达量的变化

经采用qRT-PCR对挑选的5个差异基因进行检测，与转录组测序分析结果基本一致(P<0.05)。见图1。

图1 5个差异基因qRT-PCR检测结果

5 讨论

GO(Gene Ontology)是国际标准化的基因功能分类体系。根据香连外洗液+氟康唑作用后ATCC10231差异表达基因富集的生物过程(Biological Process，BP)、细胞组分(Cellular Component，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)等推测，香连外洗液作用下，细胞膜及细胞器成分发生了变化，其增效机制可能与代谢、转运、酶活性增强等相关。

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)又称京都基因与基因组百科全书。根据香连外洗液+氟康唑作用后白念珠菌ATCC10231差异基因富集的信号通路及代谢途径，推测香连外洗液引起了耐药相关基因的下调表达,同时影响了细胞基础物质代谢。

白念珠菌细胞膜成分的改变是白念珠菌耐药的主要机制之一。其中，编码细胞膜重要成分麦角甾醇相关基因ERG11的突变及过度表达是研究最多的，本研究发现，在香连外洗液+氟康唑作用后，ATCC10231转变为氟康唑敏感株，转录组研究显示，与类固醇生物合成这一通路相关的基因ERG24、ERG251均出现了下调表达。这一结果与Su等[4]研究是相同的。同时，未见其他类固醇生物合成相关基因包括ERG11的异常表达。

目前已知与药物外排有关的多药耐药相关蛋白有2类:①ABC转运蛋白。主要由CDR1和CDR2编码，两者的过度表达是由TAC1基因编码的CDR基因转录激活因子l(Transcriptional Activator of CD Rgene l，Tac1)介导的。②易化载体超家族蛋白(Major Facilitator Superfamily，MFS)。MDR1又称为CaMDR1，是白念珠菌最重要的MFS家族多药耐药相关基因。锌簇家族中与MDR1转录调控相关的最主要的基因是多耐药调节基因(Multidrug Resisitance Regular 1，MRR1)。MRR1出现的功能获得性突变，可导致MDR1高表达引发MDR1外排功能上调出现耐药[5]。本研究中，经氟康唑+香连外洗液作用，Tac1、MRR1出现了下调表达。此外，白念珠菌ABC转运蛋白相关基因CDR1、CDR2出现了下调表达，未见其他ABC转运蛋白相关基因的异常表达；MFS家族基因TPO3、TPO2、TPO4等均出现了下调表达，未见既往研究报道最多的MFS家族多药耐药相关基因MDR1的异常表达。

在白念珠菌的致病过程中，黏附功能起了关键的作用。白念珠菌黏附基因主要包括以下几种：①菌丝壁蛋白相关基因：菌丝壁蛋白1(Hyphal wall protein l，Hwp1)及菌丝壁蛋白2(hyphal wall protein l，Hwp2)是白念珠菌重要的毒力因子，同时也与白念珠菌的黏附相关，其是由锌簇转录因子Bcr1调控表达的[6]。本研究中，经香连外洗液+氟康唑作用后，氟康唑耐药株转变为敏感株，同时，发现Hwp1、Hwp2出现了下调表达。推测，经香连外洗液+氟康唑作用后，菌株恢复了对氟康唑的敏感性，Hwp1、Hwp2的下调表达可能是香连外洗液对氟康唑抗白念珠菌增效机制之一。除此以外，生物膜相关基因RBT1也出现了下调表达，这一点与以往的研究是相同的[7]。②聚苯乙烯黏附增强蛋白相关基因(Enhanced Adherence to Polystyrene 1,Eap1)Eap1p有助于生物膜形成，其不同区域介导了白念珠菌对上皮细胞、聚苯乙烯等不同底物的黏附。研究显示，Eap1缺失的白念珠菌黏附力及持续时间明显减少[8]。本研究中，经香连外洗液+氟康唑作用后，Eap1出现了下调表达，同时出现了YWP1的上调表达，后者认为与白念珠菌黏附能力的维持相关[8]。与黏附相关的基因Eap1下调表达，而与黏附维持相关的基因YWP1出现上调，这一结果与一项关于BDSF抗白念珠菌的研究是相同的[9]。

氧化应激是白念珠菌耐受药物打击的重要生理活动，过氧化物酶是一类氧化还原酶，它们能催化很多反应，是白念珠菌细胞中重要的抗氧化酶之一[10]。经香连外洗液+氟康唑作用后的菌株，与过氧化物酶相关的CTN1、PXP2、CTN3、IDP2、POX18、POT1基因均出现下调表达。其中，PXP2、IDP2、POX18、POT1基因功能尚未确定，可能与白念珠菌氧化应激所介导的耐药机制有关。根据以上内容推断，过氧化物酶通路相关基因也是香连外洗液作用的靶点之一。

综上所述，香连外洗液对氟康唑抗耐药白念珠菌的增效作用是一个多基因参与、多个生物过程协同调控的过程。其作用的靶点与既往文献中出现的耐药基因相关，但文献报道最多的基因并没有出现异常表达，有些甚至是文献报道较少或功能尚未确定的，这说明香连外洗液有其独特的作用机制和作用靶点。这一发现为香连外洗液良好的临床疗效提供了佐证，同时也为下一步的研究提供了方向。