副流感病毒5型作为疫苗载体的研究进展

刘子宁 ， 汤新明 ， 梁 琳 ， 崔尚金

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 ， 北京 海淀 100193 ； 2.农业农村部兽用药物与诊断技术北京科学观测实验站 ， 北京 海淀 100193)

疫苗免疫是防控人类和动物疫病最经济有效的策略。以适宜的病毒、细菌等微生物或寄生虫为载体的活载体疫苗具有安全性高、能激发宿主多类型免疫应答、不需要佐剂等优势，是目前疫苗研究领域的热点之一。其中，以病毒为疫苗载体的研究最为广泛，技术也最为成熟，并且已有许多商品化的重组病毒载体疫苗。副流感病毒5型(Parainfluenza virus type 5，PIV5)为单负链RNA病毒，感染宿主范围广，单独感染一般不引起临床症状，致病性低。其基因组相对稳定，易于培养和进行遗传操作，具有作为疫苗载体的潜能。本文阐述PIV5的病原学特点、作为疫苗载体的优势，及表达异源抗原的重组PIV5激发机体免疫应答的能力和针对相应抗原的免疫保护力，为载体疫苗的设计与研制提供参考。

1 副流感病毒5型概述

PIV5属副黏病毒科(Paramyxoviridae)、腮腺炎病毒属(Rubulavirus)成员，为单股负链RNA病毒，能够从多种哺乳动物及细胞培养物中分离得到。根据国际病毒分类学委员会(ICTV)网站公布的记录显示，首次将该病毒命名为PIV5的时间为2009年。已报道的PIV5宿主包括人、猴、犬、猪、牛、虎和小熊猫等[1]。尽管PIV5可感染多种哺乳动物，但PIV5各毒株间基因序列较为保守，突变水平低，基因组在体内和体外都展现出较低的多样性，且无迹象显示其基因组间差异存在免疫或宿主特异性[2]；PIV5多由人类圈养的家畜、宠物以及动物园动物体内分离得到，其首次分离报道来自一圈养猴，但同时在野生猴体内未检测到PIV5抗体，提示了动物可能是通过接触人类而感染的，人类更可能是PIV5的自然宿主。PIV5致病力弱，单纯的PIV5感染一般不引起临床症状，一些PIV5毒株与其他病原混合感染可出现临床症状，如犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus,CPIV)与支气管败血波氏杆菌(B.bronchiseptica)、犬腺病毒(Canine adenovirus，Ad)、犬支原体(M.canis)等病原体混合感染可引起犬传染性呼吸道病(Canine infectious respiratory disease,CIRD)[3]，常在犬舍引起整窝幼犬感染，临床症状为鼻塞、咳嗽、呼吸困难、发热、嗜睡和下呼吸道感染[4]，俗称“犬窝咳”。

随着分子生物学技术的快速发展，反向遗传操作技术成为生物体基因功能及应用研究的主要工具。对病毒而言，其基因组一般较小，基因序列较易获得，借助细胞培养、细胞转染与筛选，在体外条件下拯救病毒已不是障碍。由于负链RNA病毒的组装需依赖RNA聚合酶和病毒结构蛋白组成的核糖核蛋白复合体(Ribonucleo-protein complex,RNPs)，其拯救相对DNA病毒和正链RNA病毒来说难度较大。近来年反向遗传操作技术不断发展，已有PIV5感染性克隆平台成功建立的报道，构建重组PIV5载体疫苗成为了可能。PIV5作为疫苗载体具有安全性高(致病力弱)、稳定性强(基因组变异小)、感染宿主范围广泛、易于大规模培养等优势，不断有其作为载体表达狂犬病病毒[5]、高致病性禽流感病毒(HPAI)[6]、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)[7]等高危病原体的保护性抗原，制备重组PIV5载体疫苗并进行免疫效果评价的报道。本团队主要从事宠物疫病免疫防控产品的研制，针对PIV5和本实验室分离的CPIV5毒株的病原学特性，认为CPIV5是理想的疫苗活载体，具有开发价值和应用前景。

2 副流感病毒5型病原学特点

PIV5属单负链RNA病毒目、副黏病毒科、副黏病毒亚科、腮腺炎病毒属病毒。病毒粒子呈多形性，直径在50～300 nm。病毒粒子的核衣壳呈螺旋对称，厚度约17 nm，外有囊膜包被，主要成分为来源于宿主细胞的脂质体。囊膜表面有密集的纤突结构，包括血凝素-神经酪氨酸酶糖蛋白(Hemagglutinin-neuraminidase glycoprotein,HN)和融合蛋白(Fusion protein,F)2种纤突蛋白，该纤突结构与病毒进入宿主细胞有关，也是抗体中和病毒的靶标。PIV5可在多种人和动物细胞上生长并获得高滴度培养产物，常用Vero细胞、MDCK细胞和MDBK细胞，较少引起细胞病变[2]。

PIV5基因组为不分节段的负链RNA，基因片段大约15.5 kb，共包括7个基因，编码8种蛋白，从3′端到5′端依次为核衣壳蛋白(Neucleocapsid,NP)、磷酸化蛋白(Phosphoprotein,P)或辅助蛋白(Accessory protein,V)、膜基质蛋白(Matrix protein，M)、融合蛋白F、小疏水性蛋白(Small hydrophobic protein,SH)、血凝素-神经酪氨酸酶蛋白HN和大聚合酶蛋白(Large polymerase protein,L)，它们在PIV5整个生命周期里的总表达量依次递减[8]，具有梯度转录的特性，这8种蛋白在病毒粒子表面的排布结构如图1所示。尽管PIV5可以从人和多种不同哺乳动物体内分离得到，但对来自人、猴、猪和犬的多个PIV5毒株进行序列分析和比对显示，其总核苷酸差异不超过7.8%，两两毒株间的平均差异仅为2.1%，且差异氨基酸随机分布，在不同宿主来源的毒株间无特定规律，提示该病毒的宿主特异性较低[2,9]。其中变化最显著的是SH基因编码的氨基酸，一些犬源和猪源PIV5的SH基因功能不全或缺失，可作为PIV5毒株间的差异化分子标记。由于SH蛋白可以抑制TNF-α分泌，阻断其介导的细胞凋亡[10]，缺失SH基因的PIV5细胞病变作用增强，同时诱导更强大的清除性免疫，比野生型PIV5更适合作为疫苗载体[11]。

图1 副流感病毒5型结构示意图

3 副流感病毒5型感染性克隆平台的构建

3.1 反向遗传学 PIV5载体的构建主要利用反向遗传学(Reversed genetics)技术来实现。反向遗传学技术是通过操纵基因组来进行基因突变、替换、插入和缺失，进而观察其对表型的影响的技术。病毒反向遗传学技术即是以病毒为研究对象，将病毒的RNA反转录为cDNA，在DNA层面对病毒基因组进行研究和改造，再将遗传物质转染进细胞或生物体内组装为新的病毒，称为病毒拯救。基于反向遗传操作平台，既可实现对病毒基因功能及致病机理的基础研究，又可实现对病毒致弱或插入外源基因等的改造，是人类在病毒研究领域的一项重要技术。

3.2 PIV5反向遗传操作平台构建 相较于正链RNA病毒，负链RNA病毒反向遗传操作系统较难建立。负链RNA病毒裸露的负链基因组或正链反基因组都不能作为启动感染循环的模板，产生的子代病毒不具有感染性，只有在宿主RNA聚合酶作用下与结构蛋白NP、P、L共同构成RNP后才能产生具有感染性的子代病毒。PIV5反向遗传操作系统建立的要点首先是构建正确的全长质粒，再分别构建表达NP、P、L蛋白的辅助质粒，将4种质粒以适当的比例共转染能够提供T7聚合酶的真核细胞系，实现病毒拯救。由于真核细胞不表达T7聚合酶，需额外引入，目前常用的方式有4种：(1)使用能提供T7聚合酶的重组痘病毒MVA-T7在转染前感染细胞[12]；(2)构建表达T7聚合酶的重组细胞系，如以BHK-21细胞系为基础构建的BSR-T7细胞系；(3)使用编码T7聚合酶的质粒与4个病毒质粒共转染细胞[13]；(4)使用真核细胞自身的RNA聚合酶系统(Pol Ⅱ系统)，这种方法不需要添加T7聚合酶，适用细胞种类更广，据报道对副黏病毒科病毒的拯救效率高于T7聚合酶系统[14]。

3.3 外源基因的插入 副黏病毒科病毒的NP蛋白需要结合6个碱基才能与病毒基因组相互作用，因此病毒基因组的碱基数目必须是6的倍数才能有效复制，该复制原则被称为“六碱基原则”。当插入外源基因后不满足该原则时，需要额外补充碱基使重组病毒总长度为6的倍数。PIV5从3′末端起始转录，基因起始序列(GS)和终止序列(GE)指引RNP按顺序依次对基因进行转录。拯救重组不分节段负链RNA病毒(Nonsegmented negative-strand RNA virus，NNSV)时，外源基因会以独立的开放阅读框进行转录表达。第1个被插入至PIV5基因组的外源基因是绿色荧光蛋白(GFP)基因，表达GFP蛋白的PIV5(rPIV5-GFP)具有与野生型PIV5一样的活性，为PIV5作为疫苗载体表达其他病毒保护性抗原成分的研究奠定了基础[12]。早期的研究指出，插入外源基因片段越大对PIV5载体在体内复制的影响越大，而增加小片段插入基因的数量未发现对载体的复制有明显影响，但重组病毒基因组总长度不能太长，PIV5可接受1～3个外源基因的插入，总长度在4～5 kb，为了容纳更多的外源核苷酸可以移除PIV5的SH基因[7]。此外，由于PIV5具有梯度转录的特性，外源基因的插入位置离启动子越近，表达效率越高，越远则越低；但是，有报道指出外源基因插入启动子和NP基因之间无法产生有活性的病毒粒子，插入NP基因和V/P基因之间病毒在生长时存在缺陷[11]，提示外源基因插入越靠近启动子处，载体的衰减作用越强。现存的PIV5载体疫苗多采用将外源基因插入HN基因和L基因之间的保守方法[6,11,15-16]，但也有将外源基因插入SH基因和HN基因之间[17]能够诱导宿主更强烈的免疫应答的报道。

4 副流感病毒5型作为表达载体的优势

PIV5作为新型疫苗载体有许多突出的优势：(1)PIV5安全性高，单独感染人和大多数动物均不造成临床疾病，而同属副黏病毒科的其他病毒如新城疫病毒(NDV)、犬瘟热病毒(CDV)等，由于它们本身对易感动物的致病性较强，以这些病毒制备的疫苗发生毒力返强、毒力残留的风险比PIV5更高、影响更大。即便CPIV与其他病原体混合感染对犬具有一定致病性，但其弱毒疫苗株长期与犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬传染性肝炎病毒制成联苗应用于犬只[18]，提示致弱的CPIV疫苗株作为疫苗载体也具有较高的安全性；(2)PIV5基因组结构稳定，便于多种外源基因的插入，插入的外源基因以独立的开放阅读框转录翻译，在病毒传代过程中不易丢失和突变[19]，且外源基因插入合适的位点载体毒力不变，使PIV5比许多正链RNA病毒如猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)[10]和猪塞内卡病毒[20]更加适用于作为疫苗载体；此外，PIV5遗传稳定，各毒株间差异小，几乎不与其他病毒发生基因重排，进一步增加了其作为疫苗载体的安全性；(3)PIV5仅在胞浆中进行复制，遗传物质为RNA，不存在DNA阶段，病毒基因组不会整合到宿主细胞基因组内，几乎不与宿主基因发生交换，不会对宿主产生负面影响；传统DNA病毒载体如痘病毒、腺病毒、疱疹病毒等，虽然易于构建感染性克隆平台，但其基因组复制需要在细胞核内进行，病毒DNA有错配遗留在宿主细胞内的风险，体外细胞培养过程中也存在细胞转化，相比负链RNA病毒存在一定风险[21]；(4)PIV5易于培养，大规模生产成本低，可用多种哺乳动物细胞系培养并获得高滴度培养产物，Vero细胞培养可得到8×108PFU/mL的病毒液；(5)动物先前暴露于PIV5野毒或疫苗株均不会妨碍PIV5载体疫苗诱导免疫反应的强度[18]，提示PIV5载体疫苗可以使用或重复使用于任何免疫背景的动物，如有报道指出PIV5为载体的疫苗所诱导的抗体滴度是目前在美国市场流通的其他种类疫苗的3倍[13]；(6)PIV5免疫途径多样，不局限于注射给药，鼻内给药或口服给药都能达到良好的免疫效果，适用于动物群体的大面积应用；(7)PIV5能够全面的激活宿主的免疫应答，调动全身性体液免疫、细胞免疫及局部黏膜免疫，产生高效、广范、持续的免疫应答，特别是具有高效诱导呼吸道黏膜免疫的能力。

PIV5为载体的疫苗比其他病毒载体制备的疫苗具有更优越的免疫保护性。以H1N1-NP蛋白为外源基因分别插入VACV、腺病毒5型(Ad5)和PIV5制得VV-NP、Ad5-NP和PIV5-NP，分别研究其免疫原性，结果表明PIV5-NP的免疫保护性最佳，单次接种106PFU的PIV5-NP对攻毒致死剂量H1N1的小鼠的免疫保护率为100%，且小鼠体重仅减轻10%～20%[22]；而Ad5-NP对同样处理的小鼠的免疫保护率是80%且小鼠体重减轻30%[23]，这可能与腺病毒未成功诱导呼吸道黏膜免疫有关，在表达中东呼吸综合征冠状病毒刺突蛋白(MERS-S)的Ad5中也可观察到重组病毒无法诱导黏膜免疫的现象[24]；而VV-NP在这项试验中未发挥免疫保护作用。在使用多个不同载体表达MERS-S制备疫苗的对比试验中，PIV5载体疫苗也具有明显的优势，只需单次接种104PFU PIV5-MERS-S即可100%保护攻毒小鼠免于死亡，而RABV-MERS-S则需3次接种10 μg重组病毒粒子才能达到相同的保护效果[25]。在已报道的MERS载体疫苗中，PIV5载体疫苗的效果较好。

5 重组副流感病毒5型表达其他病原抗原的免疫保护力

5.1 重组PIV5表达流感病毒抗原 流感病毒HA蛋白是PIV5作为疫苗载体首次表达的外源病毒蛋白[26]，表达H5N1和H3N2 HA蛋白的重组PIV5(rPIV5-HA)在小鼠体内都具有良好的免疫原性。PIV5在表达膜蛋白时能够把外源病毒蛋白展示在重组病毒膜表面，高效地刺激机体产生针对外源蛋白的特异性抗体[27]，在小鼠模型中证实了其具有良好的免疫保护性[17]。流感病毒HA蛋白的突变率较高，rPIV5-HA不能提供很好的交叉免疫，而流感病毒NP蛋白序列较为保守，继rPIV5-HA后即出现了表达NP蛋白的PIV5(rPIV5-NP)。rPIV5-NP在小鼠模型内对致死剂量的H1N1攻毒具有100%的免疫保护性，但小鼠存在10%～20%的体重减轻，肺组织仍然会受到病毒侵袭。NP蛋白重组痘病毒(VV-NP)几乎不具有免疫保护性；NP蛋白重组腺病毒(Ad5-NP)免疫的小鼠有20%死亡，存活小鼠的体重减轻达30%，相比较而言rPIV5-NP的免疫保护性明显要优越得多[23]，这揭示了PIV5比传统载体病毒更具作为通用型流感疫苗载体的价值。此外，由于流感病毒表面蛋白NA较HA的突变率低，表达NA蛋白的重组PIV5(rPIV5-NA)也比rPIV5-HA能产生更广泛的交叉免疫。有研究证明，rPIV5-NA可诱导小鼠产生针对H5N1和H1N1高效的中和抗体，且明显减轻临床症状[6]，为PIV5作为通用型流感疫苗载体的价值提供了进一步证明。

5.2 重组PIV5表达狂犬病病毒抗原 狂犬病是一种高度接触性、致死性的中枢神经系统疾病，尽管已有多种人用灭活狂犬病疫苗取得了不错的免疫效果，但很难应用于流浪动物和野生动物狂犬病的防控，而这恰恰是狂犬病严重威胁人类的根源。PIV5重组活载体疫苗免疫途径多样，有报道指出其经口免疫的效价与口服狂犬病弱毒苗相当，经鼻免疫的效价甚至优于狂犬病弱毒苗[28]，且比后者的生物安全性高，为流浪动物和野生动物狂犬病疫苗的研制提供了更优选择。狂犬病病毒糖蛋白(Rabies virus gloycoprotein,RVG)是狂犬病病毒主要的表面抗原，它不仅决定病毒的致病性，还是刺激宿主产生特异性中和抗体、激活免疫应答的主要蛋白。插入RVG基因的重组PIV5(rPIV5-RV)与rPIV5-HA一样能够把外源蛋白展示在重组病毒膜表面，高效地刺激机体产生针对狂犬病病毒的免疫应答[28]。此外，当进行狂犬病紧急治疗时，需要同时注射狂犬病疫苗和单克隆抗体，rPIV5-RV的一大优势是其不会被抗狂犬病毒单克隆抗体中和[5]，此时使用PIV5为载体的狂犬病疫苗比传统灭活疫苗的效果更好。

5.3 重组PIV5表达人呼吸道合胞体病毒抗原 人呼吸道合胞体病毒(RSV)主要引起儿童、老人和免疫力低下人群细支气管炎和肺炎[29-30]，尚无得到批准的疫苗上市，亟待研发安全高效的RSV疫苗。PIV5载体主要表达RSV膜表面融合蛋白(PIV5-F)和糖蛋白(PIV5-G)，在小鼠感染模型中已证实单次接种106PFU的PIV5-F或PIV5-G接种均可诱导有效的保护性免疫反应，其中PIV5-F可诱导血清中和抗体，PIV5-G免疫小鼠体内虽未检测到血清中和抗体，但PIV5-G依然能有效降低小鼠肺部的RSV病毒载量。以非洲绿猴为模型的试验中发现，PIV5-F可以最大程度的降低绿猴呼吸道内RSV的病毒滴度，比PIV5-G的免疫保护效率高[14]。对PIV5-F和PIV5-G的体外和体内培养都显示，外源RSV基因在重组病毒传代过程中持续保持高度稳定，不易突变而丢失。但是，RSV基因的插入会影响PIV5基因组的稳定性，使其在传代过程中发生一定水平的突变[17]。所以PIV5为活载体的RSV疫苗的安全稳定性还需进一步研究。

5.4 重组PIV5表达痘病毒抗原 PIV5作为载体表达痘病毒(VACV)L1R和B5R的研究在小鼠感染模型内也取得了成功[31]，这2种分泌蛋白是介导VACV胞内成熟和囊膜包被的重要蛋白。PIV5-L1R/B5R免疫可诱导小鼠产生抗VACV中和抗体，感染致死剂量VACV的小鼠经鼻内接种PIV5-L1R/B5R可显著降低病毒引起的病理学损伤。尽管免疫PIV5-L1R/B5R的小鼠仍然存在一定程度的体重减轻，但是与对照组相比其减重较少且较慢。该研究还发现，经PIV5-L1R/B5R免疫的小鼠可以免于感染VACV长达1.5年以上，其VACV抗体水平持续保持高浓度。这一发现揭示了PIV5作为长效疫苗载体的可能性。

5.5 重组PIV5表达中东呼吸综合征冠状病毒抗原 中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)感染人能够造成严重的致死性呼吸道疾病，与2003年在我国暴发的SARS-CoV以及自2019年末至今席卷全球的2019-CoV同属β属冠状病毒，亲缘关系较密切，它们感染宿主细胞的主要膜蛋白均为刺突蛋白(Spike,S)，是冠状病毒主要的保护性抗原成分。最近研究指出，表达MERS-CoV S蛋白的重组PIV5(PIV5-MERS-S)在hDPP4 KI小鼠模型内被证实可以起到可靠而有效的免疫保护作用[7]。该研究还指出，PIV5-MERS-S主要依靠激发宿主强烈的细胞免疫反应来发挥抵抗MERS-CoV感染的作用。PIV5-MERS-S免疫小鼠在攻毒MERS-CoV后可唤起强烈的MERS-S特异性CD8+T细胞的免疫反应，可完全保护小鼠免于死亡，其肺部的组织病理损伤也明显减少。PIV5-MERS-S的免疫保护效果明显优于MERS灭活苗，单次免疫104PFU的PIV5-MERS-S即可保护100%的小鼠免于死亡，而灭活MERS-CoV仅可保护25%的小鼠。除此以外，现存MERS灭活苗和SARS灭活苗易引发超敏反应的缺陷在PIV5-MERS-S免疫小鼠身上得到改善，PIV5-MERS-S造成的肺部嗜酸性粒细胞浸润和玻璃样变较MERS灭活苗少，但尚无统计学意义上的差异。尽管PIV5-MERS-S对肺内病毒的清除率高于灭活的MERS-CoV，但尚不能实现完全的清除性免疫，研究者认为，同时在PIV5载体内插入MERS-CoV的M蛋白和N蛋白可以进一步提高疫苗的病毒清除率。总之，PIV5-MERS-S比现存的灭活疫苗和许多传统病毒为载体的MERS疫苗都更能少量高效地发挥免疫保护作用[25,32-34]，且不易发生超敏反应，是非常有前景的MERS疫苗候选载体。PIV5作为MERS-CoV载体的效果优越，预示着其同样有潜力成为当下流行的2019-CoV的载体。

5.6 重组PIV5表达结核杆菌抗原 PIV5除作为其他病毒蛋白的表达载体外，也可作为细菌蛋白的表达载体。结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)引起人和动物的结核病(TB)，是一类胞内寄生菌，常规抗生素疗效不显著，常呈现持续感染，严重危害机体健康。目前获得批准的结核病疫苗只有牛结核减毒活疫苗(BCG)，但其免疫效力较低，不能有效减少结核分枝杆菌形成的结核灶。以PIV5为载体表达结核分枝杆菌抗原85A(PIV5-85A)和85B(PIV5-85B)的疫苗在小鼠感染模型内都能有效地减少肺内的结核分枝杆菌载量，其中PIV5-85A能最大程度地减少感染小鼠肺部的菌落形成单位(CFU)[35]。此外，该研究还发现，初次免疫BCG的小鼠在加强免疫PIV5-85A或PIV5-85B后能够显著提升BCG的免疫效力，细菌载量可减少103单位的CFU。这是首次有研究指出PIV5载体疫苗具有提升初次免疫的其他疫苗免疫效力的能力，拓宽了PIV5作为疫苗载体研究的领域。

6 展望

经济社会的快速发展改变了人与人、人与动物之间的交流模式和频率，使得一些疫病尤其是人兽共患传染病的暴发呈现新的态势，传统的灭活疫苗和弱毒疫苗已不能满足许多疾病的防控需求，疫苗研制也由传统疫苗的经验性研制逐步过渡到依赖先进免疫学理论和技术的新型疫苗研制。重组载体疫苗相比较于灭活疫苗更能高效地诱导细胞免疫和体液免疫，过敏反应也较轻；又比弱毒疫苗更具安全性，可以用于制备生物安全级别较高的病原体疫苗。选择合适的载体病毒是研发重组载体疫苗的关键，PIV5在众多病毒载体中优势显著，虽然由于早期反向遗传技术不够成熟，投入市场使用的活载体疫苗还多以DNA病毒为基础，但近年来负链RNA病毒反向遗传技术不断完善，PIV5极大的潜能势必在未来有极高的应用前景。在兽医领域，PIV5由于其感染犬的效率高、对大多数动物安全性良好、基因组稳定性高、易于培养、免疫途径多样和能够全面激发免疫应答等特点，作为动物疫苗载体特别是作为犬猫狂犬病疫苗载体的优势突出，比同类病毒中不具备感染犬能力的新城疫病毒(NDV)和对犬危害较大的犬瘟热病毒(CDV)都更具优势；在人类医疗领域，PIV5不致病又能经呼吸道接种，高效诱导呼吸道黏膜免疫的能力使它作为呼吸道疾病疫苗的研究引人注目，特别是在2019年末以呼吸道感染和肺炎为代表性症状的COVID-2019出现并产生全球性的暴发后，PIV5作为呼吸道疾病疫苗载体的价值有望进一步体现。