10种消毒剂对非洲猪瘟病毒的灭活效果

程 晶 ， 许 健 ， 刘文晓 , 江 波 ， 李永清

(1. 北京市农林科学院畜牧兽医研究所 ， 北京 海淀 100097 ； 2. 中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 ， 甘肃 兰州 730046)

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一种急性、烈性传染病。ASFV 感染家猪和野猪后，死亡率极高，可达100%，是我国目前养猪业主要的传染病[1]。由于目前对于该病尚无有效的疫苗和治疗药物，因此建立良好的生物安全体系是切断该病传播的最有效措施，而实施全面彻底的消毒又是生物安全体系中的关键环节。ASFV为具有双层膜结构的200 nm的大型囊膜病毒，基因组为170～193 kb的双链DNA。病毒粒子呈现复杂多层的二十面体结构，整体由内向外依次是病毒基因组、核壳、内膜、衣壳和外膜。正是由于其结构的复杂性，ASFV对外界环境有更强而广泛的耐受性。ASFV在低温保持高度稳定[2]，在冷藏条件下，血液中存在的病毒可以存活18个月，在冷冻肉中可存活1 000 d以上[3]，加热至56 ℃ 可70 min灭活，60 ℃灭活需要20 min；ASFV具有强耐酸碱性[4]，可耐受酸碱性范围从pH<3.9至pH>13，血清可增加病毒的抵抗力，例如在pH为13.4时，无血清抗性持续长达21 h，而有血清则持续7 d。世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health,OIE)手册指出ASFV对一些消毒剂敏感[5]，如用8%氢氧化钠(NaOH)作用30 min，3%福尔马林作用30 min，或3%正苯基苯酚作用30 min等均能使病毒灭活，但目前市面上消毒剂品种众多，各消毒制剂在临床上对ASFV的灭活效果表现参差不一，因此比较分析不同消毒剂对ASFV的灭活效果，对在养殖过程中防控ASFV传播和感染具有重要意义。

基于此，本试验采用细胞感染试验检测10种消毒剂对ASFV的灭活效果。基于比较分析结果，进一步选择了3种消毒剂对曾经暴发非洲猪瘟的废弃猪场进行了环境消毒验证，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 病毒 中国非洲猪瘟病毒分离株ASFV SY18ΔMGF/ΔCD2v株[6](病毒含量107.5TCID50/mL)，该病毒感染猪原代肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAM)后表达绿色荧光蛋白，由中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所提供。

1.2 细胞 PAM取自1月龄经检测ASFV抗原和抗体阴性的临床健康猪的新鲜猪肺。用止血钳夹住猪喉部下方，用线绳结扎与心脏相连的血管；采用灭菌的生理盐水或PBS冲洗肺外侧杂物，移至生物安全柜中；用酒精棉球消毒喉头部分，向肺内灌入PBS，直至肺叶全部隆起；止血钳结扎喉管，轻揉肺表面5 min，无菌收集灌洗液。反复4次后，用细胞滤器过滤全部的灌洗液，分装离心管后1 000 r/min离心5～10 min，将收取的肺泡巨噬细胞计数。将细胞稀释至2×106个细胞/mL。

1.3 消毒剂 本试验所用消毒剂为由北京首农畜牧发展有限公司提供的商品化消毒剂，主要成分和配制方法见表1。

表1 所用消毒剂的主要成分和配制方法

1.4 试剂和耗材 细胞培养用DMEM和胎牛血清，均购自Gibco公司；Cell Counting Kit-8，购自北京安必奇生物科技有限公司；ASFV荧光定量PCR检测试剂盒，购自百沃特(天津)生物技术有限公司。

1.5 病毒滴度的测定 将PAM以2×106个/孔接种于96孔板，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。将病毒液与细胞培养液按1∶10比例稀释混合后，做8个稀释度(10-3～10-10)，取100 μL各稀释液接种到8个细胞孔中。37 ℃、5%CO2培养72 h后，在荧光显微镜下观察并计算有荧光的细胞孔数，根据Reed-Muench法测定TCID50/mL的数值。本试验在中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所BSL-3实验室进行。

1.6 消毒剂稀释液对细胞状态的影响 将10种消毒液用含5%胎牛血清的DMEM细胞培养基按照200、400、800、1 600倍和3 200倍稀释。待96孔板中细胞长至单层时弃去培养基，加入100 μL含有稀释消毒剂的培养液，每个稀释度设置5个重复孔，同时设置不加消毒剂的阴性细胞孔。37 ℃孵育1 h，弃细胞上清液，更换新培养液。37 ℃孵育8 h，在光镜下观察细胞状态。利用CCK-8细胞增殖-毒性试剂盒检测并计算消毒剂处理后的细胞活性，以筛选出对细胞安全的消毒液浓度。细胞活性计算公式：

细胞活性(%)=[A1-A0]/[A2-A0]×100%

式中A1为含消毒剂和CCK8溶液的细胞孔吸光度值，A2为不含消毒剂、含CCK8溶液的阴性细胞孔吸光度值，A0为含CCK8溶液和DMEM培养液、而不含细胞的空白孔吸光度值。用酶标仪在450 nm波长处测定各孔光吸收值，可间接反映活细胞数量。判定标准：“0”表示细胞活性<10%；“1”表示细胞活性≥10%且<20%，“2”表示细胞活性≥20%且<40%；“3”表示细胞活性≥40%且<60%；“4”表示细胞活性≥60%且<80%；“5”表示细胞活性≥80%。

1.7 消毒剂灭活ASFV效果检测 将10种消毒液用细胞培养基先按照160、320、640倍和1 280倍稀释，各取80 μL稀释消毒液至96孔板，分别加入20 μL病毒液，消毒剂终浓度达到1∶200 ～ 1∶1 600，同时设置80 μL细胞培养液加20 μL病毒液作为阳性对照，并设立不加病毒液仅加100 μL细胞培养液的阴性对照，相同条件设2个重复孔。混合均匀，反应条件设室温静置0.5 h和2 h。反应结束，取各个消毒剂和病毒混合液加入含单层细胞的96孔板中，每孔100 μL。37℃孵育1 h后，弃细胞上清液，更换新培养液。37 ℃孵育72 h后，在荧光显微镜下观察结果。若消毒液在终浓度1 600倍对细胞有损伤，则继续取80 μL稀释至1 600、3 200倍和6 400倍，分别加入20 μL病毒液，消毒剂终浓度达到1∶2 000、 1∶4 000和1∶8 000，混合均匀，室温静置0.5 h 和2 h，重复上述操作检测消毒剂杀灭ASFV的效果。结果判定标准：有荧光信号，说明该稀释度的消毒剂不能将病毒全部杀死；无荧光信号，说明该稀释度的消毒剂可将病毒全部杀死。

1.8 消毒剂对猪场环境的消毒效果 根据上述消毒剂筛选结果，选取过硫酸氢钾复合物、戊二醛和次氯酸这3种消毒剂，按照其使用说明书进行稀释，在北京地区某猪场进行圈舍和场地消毒，1 h后分别采集畜栏、墙壁和场地等不同地点的样品，带回实验室后用ASFV荧光定量PCR检测试剂盒进行检测。判定标准：样品Ct值≤38并出现特定的扩增曲线，且阴性、阳性对照成立(阳性对照Ct值≤38并出现特定的扩增曲线，阴性对照无Ct值并无特定扩增曲线)，则判定为阳性。

2 结果

2.1 消毒剂对细胞状态的影响 不同浓度消毒剂对细胞状态的影响不同。加入消毒剂1 h后换液继续培养，过硫酸氢钾复合物、二氯异氰脲酸钠、次氯酸、苯扎溴铵、聚酮维碘的最低稀释度(1∶200)对细胞状态几乎无影响。戊二醛、复方戊二醛、双癸基二甲基氯化铵、碘酸混合溶液、戊二醛癸甲氯铵则对细胞状态的影响比较大，在低于400倍稀释时，无存活细胞，在800～1 600倍稀释时对细胞也产生不同程度的损害，但在3 200倍稀释时对细胞损害较小，结果见表2。

表2 不同稀释度消毒剂对细胞状态的影响

2.2 消毒剂在细胞上灭活ASFV效果检测 结果如表3所示，过硫酸氢钾复合物在200倍稀释，室温作用时间≥0.5 h，可完全灭活ASFV；二氯异氰脲酸钠和苯扎溴铵，稀释到800倍，室温作用≥0.5 h，可完全灭活ASFV；苯扎溴铵稀释到1 600倍时，室温作用2 h可完全灭活ASFV，室温作用0.5 h，不能完全灭活ASFV；聚酮维碘稀释到1 600倍，室温作用≥0.5 h，可完全灭活ASFV。由于戊二醛、复方戊二醛、双癸基二甲基氯化铵、碘酸混合溶液、戊二醛癸甲氯铵在稀释度低于1 600倍时对细胞活性影响较大，故稀释度低于1 600倍时，无法判断其对ASFV的灭活活性。次氯酸在最低稀释倍数200倍时，室温作用时间≥2 h，都无法灭活ASFV。

戊二醛、复方戊二醛、双癸基二甲基氯化铵和戊二醛癸甲氯铵在1 600倍稀释时对细胞活性有影响，稀释至3 200倍以上时对细胞状态影响较小。上述消毒剂在细胞安全剂量范围的稀释度内(4 000～8 000倍 稀释)可有效灭活ASFV，灭活病毒能力较强。虽然在8 000倍稀释比例下，碘酸混合溶液处理仍有ASFV病毒粒子的存在，然而，在4 000倍细胞安全剂量的处理下能有效灭活ASFV，这表明碘酸混合溶液也具有灭活ASFV的能力，见表3。

表3 不同稀释度消毒剂室温作用0.5 h和2 h对ASFV的影响

2.3 3种消毒剂对猪场环境的消毒效果 选取体外细胞试验表明灭活效果好、中、差的过硫酸钾复合物、戊二醛和次氯酸3种消毒剂，在北京地区某曾经暴发过非洲猪瘟的废弃猪场进行圈舍和场地消毒1h后，分别采集地面畜栏、墙壁和场地等不同地点的样品，以ASFV荧光定量PCR检测试剂盒进行检测，结果如表4所示，过硫酸钾复合物和戊二醛能够有效灭活ASFV，消毒后Ct值均大于38，且无特征性扩增曲线，次氯酸消毒后的畜栏和场地样品的Ct值为12.55和14.56，且出现特征性扩增曲线，这表明过硫酸钾复合物和戊二醛消毒后的环境中的样品无ASFV核酸的检出，但次氯酸未能灭活ASFV，消毒后的环境样品仍有ASFV核酸的检出。

表4 荧光定量PCR检测3种消毒剂对猪场环境消毒效果

3 讨论

ASFV是一种对宿主猪感染力极强、传播性极高的病毒。该病毒自2018年传入我国以来，给我国养猪业造成巨大损失和极度恐慌。由于目前尚无疫苗等防控技术手段，严格而合理的生物安全防控成为保障猪场发展的最可靠屏障[7]。在所有的生物安全操作过程中，对养殖环境采用消毒剂进行消毒是最为核心的手段，而正确选择和使用消毒剂是消毒有效的重要前提。由于当前我国市场上消毒剂品种繁多，难以选择对ASFV灭活效果最佳的产品，因此本试验挑选了10种普遍使用的消毒剂，首先在猪肺巨噬细胞上进行了ASFV的体外灭活试验。结果发现，过硫酸氢钾复合物、二氯异氰脲酸钠、苯扎溴铵和聚酮维碘对肺泡巨噬细胞的影响较小，在较低浓度的稀释比例下可有效灭活猪肺泡巨噬细胞中的ASFV；戊二醛、复方戊二醛、双癸基二甲基氯化铵、碘酸混合溶液、戊二醛癸甲氯铵对猪肺泡巨噬细胞的影响较大，但在细胞安全剂量的情况下，依然能够有效灭活肺泡巨噬细胞中的ASFV。然而，次氯酸在细胞的安全浓度下不具有灭活ASFV的作用。

体外评价消毒剂灭活ASFV的效果可采用悬液定量法，通过测定加入消毒剂前后病毒含量的变化，来判定消毒剂的灭活效果[7]。测定ASFV病毒含量的方法通常有红细胞吸附试验和间接免疫荧光(IFA)[8]。红细胞吸附试验需要制备新鲜SPF猪的红细胞，并且不同批次的红细胞吸附能力不同，甚至有些毒株不具有红细胞吸附能力；IFA测定病毒滴度耗时长，加之需要抗体等昂贵试剂，加大了检测的成本。本试验采用的ASFV SY18ΔMGF/ΔCD2v株由于缺少了相应的毒力基因，因此生物安全风险大为降低，且其感染PAM后表达绿色荧光蛋白，因此可直接通过荧光显微镜观察荧光信号来判读结果，具有高效、快速和经济等优点。

消毒剂对病毒的体外灭活效果通常是在实验室理想状态条件下进行的，但在临床实际消毒实施过程中，消毒剂的使用效果可能会出现偏差，其原因可能是有机物的存在抵消了消毒剂的作用[9]，即血液、粪便等有机物存在的条件下，病毒更稳定、存活时间更长；猪栏和畜舍的漏缝地板、水泥底面和饲槽等各种设施经过多次使用后，在其表面会形成由粪便、灰尘和细菌组成的生物膜，会阻碍消毒剂有效成分与病原微生物的接触；环境中存在降低消毒剂的浓度或改变消毒剂pH等因素。为此，本试验基于细胞体外试验的结果，挑选了3种正规上市的商品化消毒剂，根据其使用说明书对北京地区某曾经暴发过非洲猪瘟的废弃猪场进行圈舍和场地消毒1h后，分别采集畜栏、墙壁和场地等不同地点的样品，使用ASFV荧光定量PCR检测试剂盒检测ASFV核酸，结果显示过硫酸氢钾复合物、戊二醛对环境中的ASFV核酸具有较好的清除作用，但次氯酸未能降低猪圈内残留的病毒核酸，甚至可能有具有活性的病毒存在，从而证实了本试验中细胞体外试验结果的可靠性。需要指出的是：很多人认为，消毒剂在环境中灭活病毒后，检测病毒核酸意义不大。这种观点对酒精等仅破坏病毒囊膜的消毒剂是合理的，但强氧化物等消毒剂可以使病毒核酸发生氧化还原反应，火碱等碱性消毒剂可以使病毒核酸发生中和反应，破坏病毒的核酸结构和性质，所以这些消毒剂对猪场进行消毒不仅能够灭活病毒，更重要的是可以降解和清除病毒核酸，因而利用荧光定量PCR方法检测病毒核酸来评价消毒剂的使用效果是可行的[10]。建议养殖场多考虑使用过硫酸氢钾复合物、二氯异氰脲酸钠、戊二醛、苯扎溴铵和聚酮维碘等消毒剂防控ASFV的感染。