实时荧光PCR方法检测多种食源性致病菌的研究

姬莉莉

【摘要】目的：应用实时荧光PCR技术（real time PCR）联合检测小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157、副溶血弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌和结肠弯曲菌。方法：针对小肠结肠炎耶尔森菌foxA基因、霍乱弧菌ompW基因、肠出血性大肠杆菌O157 rfbE基因、副溶血弧菌TLH基因、沙门氏菌ssaR基因、志贺氏菌ipaH基因、空肠弯曲菌hipo基因和结肠弯曲菌glyA基因，在其保守区域设计特异性引物和探针，检测多种病原菌的特异性和灵敏度，并对临床样本和模拟样本进行检测，联合鉴别多种食源性致病菌。结果：该方法特异性强，与单核细胞增生李斯特菌、普通变形杆菌、绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、轮状病毒A组、轮状病毒B组、轮状病毒C组、诺如病毒G Ⅱ、札如病毒、星状病毒、肠道腺病毒核酸无交叉反应;灵敏度高，检测阳性样品均可达102 copies/mL;检测30份临床样本和50份模拟样本，准确性100%。结论：多种食源性致病菌实时荧光PCR检测方法准确、可靠、操作简单，今后可以大规模加速多种食源性致病菌的检测。

【关键词】实时荧光PCR ;食源性致病菌;核酸检测;

【中图分类号】R183【文献标识码】A 【文章编号】2096-5249（2022）15-0178-04

食源性疾病是由于食用被病原体或其毒素污染的食物或水引起的一类疾病。引起食源性疾病的病原体通常被称为食源性病原体，包括细菌，病毒，真菌和寄生虫。自上世纪90年代起，食源性疾病的发病率显著增加，已成为世界范围内严重的公共卫生问题。根据世界卫生组织（WHO）的报告[1]，全世界每年有6亿人因食用受污染的食物而患病，其中420万人死亡。根据美国疾病预防控制中心（CDC）的报告，美国食源性疾病大约有4800万例次，每年有12.8万例住院治疗，每年3000例死亡病例。近年来，中国也开始监测食源性疾病。2015年全国31个监测地区共上报食源性疾病暴发事件2401起，累计发病21374例，死亡139例[2]。食源性病原体的传播来源于各种无任何处理的即食产品、生食或食用未煮熟的食品（如水果、蔬菜、海鲜、肉类和家禽）[3]。鉴于食源性疾病给全球公共卫生和经济带来的负担，开发可靠、快速的病原体检测方法至关重要。

传统的基于培养的方法仍被视为病原菌鉴定的“金标准”，但该技术有几个缺点，如检测费时费力，难以定量分析，缺乏良好的灵敏度，不能同时检测多种食源性病原体[4]。因此，需要一种快速、高度灵敏且价格低廉的检测技术。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是最常用的分子检测方法之一。 PCR 技术可以通过检测病原体特定的目标靶DNA 序列来检测食物中存在的单一病原体。多重荧光 PCR 技术因其更低检测限、闭管实时检测和兼容多款检测设备，已成为目前应用最广的检测技术。

本研究以小肠结肠炎耶尔森菌foxA基因、霍乱弧菌ompW基因、肠出血性大肠杆菌O157 rfbE基因、副溶血弧菌TLH 基因、沙门氏菌ssaR基因、志贺氏菌ipaH基因、空肠弯曲菌hipo基因和结肠弯曲菌glyA基因作为目标基因，旨在建立一种可以同时检测小肠结肠炎耶尔森、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157、副溶血弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌和结肠弯曲菌8种食源性致病菌的多重PCR 检测方法，为食源性疾病爆发和食物中毒应急处置提供准确、可靠、操作简单的检测技术。

1 材料与方法

1.1 菌株与DNA制备

小肠结肠炎耶尔森、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌 O157、副溶血弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌和结肠弯曲菌样品。菌株DNA 提取采用细菌核酸提取试剂盒，并按照操作说明书进行实验操作。

1.2 仪器与试剂

SSNP-3000A 核酸提取仪（江苏硕世生物科技股份有限公司），ABI 7500荧光定量 PCR 仪（美国Thermo Fisher 公司）。阳性对照质粒（上海捷瑞生物技术有限公司），SDK60108细菌核酸提取试剂盒（江苏硕世生物科技股份有限公司），One Step ZZ 核酸扩增反应液（上海硕颖生物科技有限公司）。

1.3 引物的设计与合成

通过 NCBI 查找小肠结肠炎耶尔森菌foxA基因、霍乱弧菌ompW基因、肠出血性大肠杆菌O157 rfbE基因、副溶血弧菌 TLH 基因、沙门氏菌ssaR基因、志贺氏菌ipaH基因、空肠弯曲菌hipo基因和结肠弯曲菌glyA基因的基因组序列，通过 Primer Express3.0.1进行序列比对，采用BioEdit在选择保守区设计特异性引物和探针。所用引物和探针均有上海硕颖生物科技有限公司合成。

1.4 实时荧光PCR反应

实时 PCR 反应体系如下：在25μL 反应体系中， One Step ZZ 核酸扩增反应液7.5μL、酶混合液5μL、引物探针反应液7.5μL、模板溶液5.0μL，灭菌双蒸水补足体积至25μL。实时 PCR 反应条件如下：95℃预变性5 min;95℃变性10 s，55℃退火延伸30 s，经40个循环;55℃时荧光检测，检测通道选择：FAM、VIC、 ROX、CY5。

1.5 特异性试验

选择与感染部位相同或感染症状相似的其他病原体核酸，包括单核细胞增生李斯特菌、普通变形杆菌、绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、轮状病毒 A 组、轮状病毒 B 组、轮状病毒 C 组、诺如病毒 G Ⅱ、札如病毒、星状病毒、肠道腺病毒共计13种病原体核酸，对荧光 PCR 方法进行特异性检测。

1.6 灵敏度试验

选取8种食源性致病菌质粒评价该方法的灵敏度。将标准质粒以10倍梯度稀释成一系列标准品，选取101 copies/mL～105 copies/mL 共5个梯度进行 DNA 核酸提取后再进行荧光 PCR 检测。每个浓度梯度稀释液重复3份，每份進行20次重复检测，具有90%以上阳性检出率的浓度水平作为最低检出限。

1.7 临床样本及模拟样本检测

本试验共收集30例临床样本和50例模拟样本，提取细菌DNA，用1.4部分所述得方法对样品进行检测，同时与常规培养进行比较，进一步确定该方法得可靠性。

1.8 统计学分析

所有检测阳性结果和阴性结果数据均采用 Excel 进行统计分析，计算阳性检出率。阳性检出率（%）=阳性样本检出数（n）/待测样本总数（N）×100%。

2 结果

2.1 特异性试验结果

小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌 O157、副溶血弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌和结肠弯曲菌均可检测到相应的典型扩增曲线（图1A 和 B），并且与感染部位相同或感染症状相似的其他病原体包括单核细胞增生李斯特菌、普通变形杆菌、绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、轮状病毒 A 组、轮状病毒 B 组、轮状病毒 C 组、诺如病毒 G Ⅱ、札如病毒、星状病毒、肠道腺病毒共计13种病原体核酸无交叉反应（图1C），试验结果显示特异性良好，没有出现非特异性扩增信号。

2.2 灵敏度试验结果

试验结果表明，稀释度为102 copies/mL 的小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌 O157、副溶血弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌和结肠弯曲菌阳性检出率分别为92%、92%、97%、93%、90%、95%、93%、90%，阳性检出率均大于90%，故小肠结肠炎耶尔森、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌 O157、副溶血弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌和结肠弯曲菌灵敏度均可达102 copies/mL（表1）。

2.3 样本检测结果

采用本试验所建立的方法对30例经过培养法鉴定的临床样本和50例使用阳性细菌制备的模拟样本进行检测，试验结果表明，检测到沙门氏菌10例，志贺氏菌10例，结肠弯曲菌10例，空肠弯曲菌10例，小肠结肠炎耶尔森菌10例，肠出血性大肠杆菌 O15710例，副溶血弧菌10例，霍乱弧菌10例，与常规确认方法检测结果一致，准确性100%。

3 讨论

在我国有研究报道2015年至2017年江西南昌食源性致病菌监测694份样品中共检测出食源性致病菌57株，阳性率达8.21%[5]。在2019年甘肃清水食源性爆发事件的研究报道，研究者对采集的986份食品中共检出132株食源性致病菌，阳性率达13.39%[6]。食源性致病菌导致人类胃肠炎、败血症等疾病，其发病率不断增加，严重威胁人们的生命健康，引发全球范围内的重大公共卫生问题。食源性致病菌的快速准确检测是预防疾病的重要手段，然而，常规微生物分离培养方法耗时且费力，因此高灵敏的快速检测方法是非常必要的。目前，检测技术已由培养水平向分子水平方向发展，尤其以高效特异性强、快速、低成本为优势的分子生物学检测技术为主，包括常规 PCR、多重 PCR、荧光实时 PCR 技术等[7]。PCR 技术是最常用的分子生物学检测方法之一。PCR 技术早期已被广泛应用于许多食源性致病菌如单核细胞增生李斯特菌，大肠杆菌O157∶H7，金黄色葡萄球菌，空肠弯曲杆菌，沙门氏菌和志贺氏菌的检测[8]。但单重PCR 技术检测通量不高，已经逐渐被多重 PCR 技术和多重荧光 PCR 技术替代。多重 qPCR 检测也开发用于多种食源性病原体的检测和定量。杨国兴等[9]采用多重 PCR 技术对肉制品标本中的金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门氏菌SipB基因、志贺氏菌ipaH基因、单核细胞增生李斯特菌inlA基因4种常见食源性病原菌进行检测。魏霜等[10]建立多重富集定量 PCR 针对collagenase、gyrB、ompW、vvhA同時检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌。有研究者通过使用基于分子信标的多重 qPCR 检测肠道沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌 O157、副溶血性弧菌、创伤弧菌、空肠弯曲杆菌、阪崎肠杆菌和志贺氏菌的靶基因（ssaR、hlyA、rfbE、toxR、vvh、gyrA、16SrRNA 和ipaH）[11]。多重荧光 PCR 技术因其更低检测限、闭管实时检测和兼容多款检测设备，已成为目前应用最广的检测技术。

本研究采用的多重荧光 PCR 技术适用于待测样本中多种靶基因核酸的定性检测，即在一次 PCR 反应中使用双管同步检测小肠结肠炎耶尔森菌foxA基因、霍乱弧菌ompW基因、肠出血性大肠杆菌 O157 rfbE基因、副溶血弧菌 TLH 基因、沙门氏菌ssaR基因、志贺氏菌ipaH基因、空肠弯曲菌hipo基因和结肠弯曲菌glyA基因共8种食源性致病菌特异性基因。该方法特异性强，与常见腹泻的其他病原体如单核细胞增生李斯特菌、普通变形杆菌、绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、轮状病毒 A 组、轮状病毒 B 组、轮状病毒 C 组、诺如病毒 G Ⅱ、札如病毒、星状病毒、肠道腺病毒等无交叉反应。其灵敏度高，以具有90%以上阳性检出率的浓度水平作为最低检出限进行统计分析，本研究的食源性致病菌病原体的最低检出限为102 copies/mL。杨梦婕等建立的GeXP多重 PCR 检测技术对测大肠杆菌 O157∶ H7、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特菌和沙门氏菌6种常见食源性致病的最低检测下限为103 CFU/mL[12]。张静等报道多重高分辨熔解曲线技术结合荧光实时 PCR 同时检测鸡肉中的反应体系检测中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和空肠弯曲菌的灵敏度均为102 copies/mL[13]。本研究建立的多重荧光 PCR 检测方法对食源性致病菌的检测灵敏度与此文献报道相似。为进一步验证该方法的准确性，本试验对30例经过培养法鉴定的临床样本和50例使用阳性细菌制备的模拟样本进行检测，试验结果表明该荧光 PCR 方法与常规确认方法检测结果一致，准确性100%，表明该方法具有较好的检测准确性。

本研究初步建立了小肠结肠炎耶尔森菌、结肠弯曲菌、肠出血性大肠杆菌 O157、副溶血弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌和霍乱弧菌8种食源性致病菌多重荧光 PCR 检测方法，通过对本方法的特异性、灵敏度和准确性的分析评价，显示该方法特异性强、检测灵敏度较高，操作简便，快速准确，具有适用于同步鉴别多病原靶标的优势，适于推广应用。

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（收稿日期：2022-01-29）