加味独活寄生合剂对兔膝骨关节炎显微结构的影响

黄璐　谭旭仪　邝高艳　卢敏

【摘 要】目的：观察加味独活寄生合剂对兔膝骨关节炎显微结构的影响。方法：采用随机数字表法将80只白兔分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组和独活寄生组，每组20只。除正常对照组外，其余组均成功制备KOA模型。独活寄生组给予加味独活寄生合剂6.8 mL·kg^-1·d^-1灌胃，阳性对照组给予盐酸氨基葡萄糖胶囊0.07 g·kg^-1·d^-1灌胃，正常对照组和模型对照组给予等剂量生理盐水灌胃。在实验干预前、干预第2，4，8周时，对关节软骨形态及显微结构进行观察，并采用番红固绿染色进行Mankins关节软骨评分。结果：与模型对照组比较，独活寄生组膝关节大体观察得到有效改善。模型对照组、阳性对照组、独活寄生组Mankins软骨评分在干预前和干预第2，4，8周均高于正常对照组，且阳性对照组、独活寄生组Mankins软骨评分在干预第2，4，8周均低于模型对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。结论：加味独活寄生合剂可有效改善KOA关节软骨显微结构，这可能是其治疗KOA的作用机制。

【关键词】 膝骨关节炎;加味独活寄生合剂;软骨;显微结构;实验研究;白兔

Effect of Jiawei Duhuo Jisheng Heji（加味独活寄生合剂）on Microstructure of Rabbit Knee Osteoarthritis

HUANG Lu，TAN Xu-yi，KUANG Gao-yan，LU Min

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Jiawei Duhuo Jisheng Heji（加味独活寄生合剂）

on the microstructure of rabbit knee osteoarthritis（KOA）.Methods：Eighty white rabbits were randomly divided into a normal control group，a model control group，a positive control group and a Duhuo Jisheng group，with

20 rabbits in each.KOA models were successfully prepared in all groups except the normal control group.The Duhuo Jisheng group was given 6.8 mL·kg^-1·d^-1of Jiawei Duhuo Jisheng Heji by gavage，the positive control group was given 0.07 g·kg^-1·d^-1of glucosamine hydrochloride capsule by gavage，and the normal control group and model control group were given the same dose of normal saline by gavage.The morphology and microstructure of articular cartilage were observed before the experimental intervention and at the 2nd，4th and 8th weeks of the intervention，and the Mankins articular cartilage score was performed by safranine solid green staining.Results：Compared with the model control group，by general observation the knee joint in the Duhuo Jisheng group was effectively improved，Mankins cartilage in model control group，positive control group，Angelica pubescens parasitic group.The scores were higher than those of normal control before intervention and at 2，4 and 8 weeks after intervention Group，and mankins cartilage score of positive control group and Angelica pubescens parasitic group.At 2，4，and 8 weeks of intervention，it was lower than that in the model control group，the difference being statistically significant（P < 0.05）.Conclusion：Jiawei Duhuo Jisheng Heji can effectively improve the microstructure of KOA articular cartilage，which may be the mechanism of its treatment of KOA.

【Keywords】 knee osteoarthritis;Jiawei Duhuo Jisheng Heji（加味獨活寄生合剂）;cartilage;microstructure;

experimental research;white rabbit

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病，系软骨细胞、细胞外基质以及软骨下骨三者降解与合成偶联失衡的结果，故软骨的退变与本病的发生、发展密切相关[1-5]。笔者前期提出KOA存在“虚、瘀、毒”病机特点，以此组方而成的加味独活寄生合剂对KOA临床验效颇佳[6-14]。本研究拟观察加味独活寄生合剂对KOA软骨显微形态的影响，进一步探讨其对KOA的作用机制，现总结如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级新西兰健康成年大耳白兔共80只，雌雄各半，体质量约2.0 kg，由湖南省中医药研究院动物实验室代购，实验动物使用许可证号SYXK（湘）2020-0008。饲养条件：温度25 ℃，湿度50%左右，自由饮水及进食。

1.2 实验药物 加味独活寄生合剂（湖南中医药大学第一附属医院骨伤科院内制剂，产品批号20180625，规格250 mL），功效为补益肝肾、祛风除湿、行气活血、解毒通痹。药物组成：独活6 g、桑寄生18 g、杜仲12 g、牛膝6 g、细辛3 g、秦艽6 g、茯苓12 g、肉桂3 g、防风6 g、川芎6 g、党参12 g、甘草3 g、当归12 g、白芍10 g、熟地黄15 g、制天南星6 g、黄芩6 g、木瓜12 g、威灵仙12 g。盐酸氨基葡萄糖胶囊（澳美制药有限公司，产品批号6171778，规格0.75 g）。

1.3 实验试剂 番红固绿染色试剂盒（Wellbio公司，产品批号WB03015A）;石蜡（上海国药生物公司，产品批号20190106）;中性树胶（上海懿洋仪器有限公司，产品批号20190116）;磷酸盐缓冲溶液（Wellbio公司，产品批号WB20190127）;体积分数为10%的甲醛（南昌雨露实验器材有限公司，产品批号180602）。

1.4 实验仪器 切片机（浙江金华益迪试验器材公司，型号YD-315）;切片刀（德国莱卡公司，型号M199型）;包埋机（常州中威电子仪器公司，型号BMJ-A）;生物显微镜（麦克奥迪MOTIC公司，型号BA210T）;盖玻片（江苏海门市远泰实验器材厂，型号DY89-1）;载玻片（江苏海门市远泰实验器材厂，型号AY89-2）;石膏绷带（上海华埠医疗科技有限公司，规格10 cm×460 cm）。

2 实验方法

2.1 动物分组 采用随机数字表法，按照体质量均衡性原则将80只新西兰健康成年大耳白兔随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组和独活寄生组，每组20只。

2.2 动物造模 模型对照组、阳性对照组和独活寄生组白兔参照张洪等[15]报道石膏制动制作KOA动物模型方法。采用右后膝关节伸直位石膏管型固定方法持续固定6周制备兔KOA模型。此时，白兔右后膝稍肿胀，关节主动、被动活动差，结合干预前各组关节软骨及滑膜大体观察、关节软骨显微结构确定KOA造模成功。

2.3 药物干预 模型验证KOA造模成功后，参照《药理实验方法学》中人-白兔等效剂量折算公式[16]计算出灌胃剂量，独活寄生组给予加味独活寄生合剂6.8 mL·kg^-1·d^-1（稀釋到10 mL·kg^-1·d^-1），即4.5152 g·kg^-1·d^-1灌胃。阳性对照组给予盐酸氨基葡萄糖胶囊0.07 g·kg^-1·d^-1灌胃，正常对照组、模型对照组给予等剂量生理盐水10 mL·kg-1·d-1灌胃。

2.4 观察指标 在药物干预前，干预第2，4，8周时，各组分别随机选择5只白兔，取股骨内髁，经体积分数为10%的甲醛固定后，进行脱钙、固定、切片等;采用番红固绿染色观察软骨显微形态，并参照改良Mankins关节软骨评分，从软骨结构、细胞形态、基质染色等3个方面进行评价。评分越高，说明关节软骨损伤的程度越严重。

2.5 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料以表示，满足正态性和方差齐性时采用单因素方差分析（LSD法）。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组白兔膝关节大体观察 各组白兔均成活到预定观察时间，其中正常对照组关节面完整，色泽正常，软骨表面光滑，有光泽。模型对照组关节面粗糙，有糜烂或溃疡形成，色泽灰暗，软骨缺损深达软骨表中层。阳性对照组和独活寄生组在干预前关节面粗糙，色泽灰暗;随着药物干预后，关节面色泽灰暗逐渐好转。见图1至图4。

3.2 各组白兔膝关节软骨显微结构观察和Mankins软骨评分比较 经造模后，模型对照组、阳性对照组、独活寄生组膝关节软骨细胞排列不规则，潮线稍有模糊或断裂，染色不均匀，可见失染现象。经药物干预后，阳性对照组、独活寄生组膝关节软骨组织表面稍有不平整，软骨细胞排列有序，潮线较清晰，染色逐渐均匀。根据兔膝关节Mankins软骨评分进行评价，发现模型对照组、阳性对照组、独活寄生组Mankins软骨评分在干预前和干预第2，4，8周均高于正常对照组，且阳性对照组、独活寄生组Mankins软骨评分在干预第2，4，8周均低于模型对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1，图5至图8。

4 讨 论

KOA主要临床表现为膝关节疼痛、肿胀、活动受限、行走能力下降，有时可出现关节响声，严重时关节畸形（如膝内翻或外翻畸形）[17-20]。目前，KOA的具体发病机制仍未完全明了。近年来，学者从不同角度进行了大量研究，并提出了许多学说，如细胞因子学说、骨内高压学说、自由基学说、软骨酶降解学说等[21-22]。在力学和生物学等多因素共同作用下，关节软骨细胞、细胞外基质以及软骨下骨三者降解与合成偶联失衡，导致KOA的发生和发展，出现软骨变性破坏等病理改变。

加味独活寄生合剂系在独活寄生汤基础加木瓜、威灵仙、黄芩、制天南星制备而成。木瓜舒经活络，祛湿除痹;威灵仙辛散温通，性猛善走，两者配伍刚柔相济，入腑通络。黄芩为反佐药物，取其苦寒清热燥湿，制约全方温燥之性;制天南星善入经络祛风解痉治疗风痰证，二药寒热相互制约，防止过寒过热，更降低制天南星的毒性和燥性，增强清热化痰息风的作用，对于关节灼热肿胀或寒邪阻滞经络所致的活动不利、筋脉挛缩均有治疗作用[23-28]。诸药合用，共奏补益肝肾、祛风除湿、行气活血、解毒通痹之功效。前期实验也发现加味独活寄生合剂可调控KOA软骨Wnt/β-catenin信号通路，减少软骨细胞凋亡，促进关节软骨的增殖修复[29-30]。

本研究结果发现，与正常对照组比较，模型对照组、阳性对照组、独活寄生组在干预前和干预第2，4，8周，Mankins软骨评分上升，差异有统计学意义（P < 0.05）;与模型对照组比较，独活寄生组膝关节大体观察和Mankins软骨评分得到有效改善，差异有统计学意义（P < 0.05）。提示加味独活寄生合剂可有效改善KOA关节软骨显微结构，这可能是其治疗KOA的作用机制。

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收稿日期：2021-10-15;修回日期：2021-12-21