富含胶原蛋白肉制品中亚硝酸盐检测方法改进

张新 向俊 唐文杰 ?康绍英 胡小军

摘 要：为解决富含胶原蛋白肉制品亚硝酸盐检测过程中出现的样液混浊、难以过滤、实验回收率低等问题，本方法引入木瓜蛋白酶对富含胶原蛋白肉制品进行分解，通过加标实验和精密度实验发现，本方法加标回收率在93.6%～97.8%，相对标准偏差范围在1.7%～4.1%。方法的改进有效地解决了该类食品的亚硝酸盐检测过程中出现的困扰，极大地提高了检测的准确度。

关键词：胶原蛋白;肉制品;亚硝酸盐;木瓜蛋白酶

Improved Detection Method of Nitrite in Collagen-Rich Meat Products

ZHANG Xin1，2， XIANG Jun1，2， TANG Wenjie1，2， KANG Shaoying1，2， HU Xiaojun1，2

（1.Hunan Provincial Key Laboratory of Food Safety Monitoring and Early Warning， Changsha 410007， China; 2.Hunan Provincial Institute of Produce and Goods Quality Inspection， Changsha 410007， China）

Abstract： In order to solve the problems of turbidity of sample solution， difficult to filter and low experimental recovery in the detection process of collagen-rich meat products， papain was introduced in this method to decomposed collagen-rich meat products. The results were found by standard test and precision test： the recoveries were 93.6%～97.8%， and the relative standard deviations were 1.7%～4.1%. The improvement of the method effectively solved the trouble in the process of nitrite detection of this kind of food， and greatly improved the accuracy of detection.

Keywords： collagen; meat products; nitrite; papain

膠原蛋白为细胞外基质的重要成分，具有良好的延伸性能[1]，主要归结于其含有一个或者多个由α-链组成的三螺旋结构，同时还含有少量的葡萄糖和半乳糖。胶原蛋白在皮肤组织细胞中主要承担储水功能，保持皮肤的细嫩度，柔软度及弹性度的生理功能[2-4]。近几年，随着人们生活品质的提高和对健康的重视，富含胶原蛋白的肉制品越来越受到大家的青睐。在肉制品中加入亚硝酸盐可以起到护色及防腐作用，但亚硝酸盐可与血红蛋白结合，生成高铁血红蛋白，使红细胞运输氧的能力减弱，对人体造成危害，因此肉制品中亚硝酸盐含量是每年国家抽检的重点检测项目，成人亚硝酸盐中毒的剂量为0.3～0.5 g，亚硝酸盐摄入量超过3.0 g会产生严重的致死风险[5]。GB 2762—2017 规定，肉制品中亚硝酸盐的限量值为30 mg/kg。有研究表明，长期过量食用富含亚硝酸盐的食品可能诱发高铁血红蛋白症，同时还会增加患癌症风险[6-9]。

目前亚硝酸盐的检测国家标准为GB 5009.33—2016，标准规定，样品进行前处理时需要进行加热，此时富含胶原蛋白的肉制品往往会出现溶液混浊、难以过滤、实验回收率低等现象。因此，很有必要对该类产品亚硝酸盐的测定方法进行改进。邵明华[10]通过先定性筛选，再定量检测的方法对国标法进行了改进，能一定程度上减少检验时间，提高检验员工作效率，但是该方法容易出现假阳性的现象，导致漏检事故发生;同时样品本身颜色较深时对定性结果也存在一定干扰。木瓜蛋白酶属于一种半胱氨酸蛋白水解酶，具有良好的稳定性和很强的蛋白水解能力，可以从番木瓜及其根茎中提取得到。它可以通过切割氨基酸的肽键的方式改变蛋白质的结构，对蛋白质进行水解，从而有效降低蛋白质的分子量[11-14]。本方法利用木瓜蛋白酶对胶原蛋白良好的分解作用，对胶原蛋白进行分解处理，从而有效解决该类产品亚硝酸盐测定过程中存在的难题。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

5种富含胶原蛋白的不同食品：样A为香辣猪脚;样B为卤鸡爪;样C为腊猪脸;样D为卤鸭掌;样E为五香猪皮，以上样品均为市场上购买。

木瓜蛋白酶（酶活力≥3 700 U/g）、硼酸钠、亚铁氰化钾、盐酸、盐酸萘乙二胺、对氨基苯磺酸、乙酸锌和亚硝酸盐标准液。所用试剂均为分析纯，所用水均为超纯水。

1.2 仪器与设备

万分之一电子分析天平，奥豪斯仪器有限公司;DZKW-4电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司;紫外可见光分光光度计（T9CS），北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

准确称取5 g均匀试样于锥形瓶中，再加入0.1 g木瓜蛋白酶，同时加12.5 mL 50 g/L饱和硼砂溶液，加入大约150 mL、70 ℃左右的超纯水，手动摇匀后放置沸水浴中加热15 min。取出冷却至室温，将样液全部转移到200 mL容量瓶中，分别加入5 mL 106 g/L亚铁氰化钾溶液和5 mL 220 g/L乙酸锌溶液，最后用超纯水定容。静置30 min后用滤纸过滤，初滤液30 mL弃去不用，后面滤液备用。同时按照GB 5009.33—2016准确称取5 g均匀试样于锥形瓶中，加12.5 mL 50 g/L饱和硼砂溶液，加大约150 mL、70 ℃左右的超纯水，混匀，于沸水中加热15 min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。定量转移上述提取液至200 mL容量瓶中，加入5 mL 106 g/L亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5 mL 220 g/L乙酸锌溶液。加水至刻度，摇匀，放置30 min后用滤纸过滤，弃去初滤液30 mL，滤液备用。相较于国标法，本法前处理加入了木瓜蛋白酶对样品中胶原蛋白进行酶解。

1.3.2 亚硝酸盐的测定

于50 mL具塞比色管中准确吸取40.0 mL前处理好的滤液，同时另外准确吸取相当于0 μg、1.0 μg、2.0 μg、3.0 μg、4.0 μg、5.0 μg、7.5 μg、10.0 μg和12.5 μg的亚硝酸钠标准使用液，分别置于50 mL具塞比色管中。将2 mL 4 g/L对氨基苯磺酸溶液分别加入标准管与试样管中，混匀，静置5 min后各加入1 mL 2 g/L盐酸萘乙二胺溶液。定容摇匀，静置15 min。在波长538 nm处用1 cm比色杯测量标准液和样液的吸光度，通过绘制标准曲线比较得到样液浓度。同时做试剂空白。

2 结果与分析

2.1 本方法与国标法前处理样液吸光度对比

对样A、样B、样C、样D和样E分别按国标GB 5009.33—2016和本方法进行前处理。将处理的样液于波长538 nm处测吸光度，所测结果如表1所示。本方法处理的样液吸光度明显小于国标法处理的样液，国标法处理的样液混浊，而本方法处理的样液明显澄清透明，其原因在于富含胶原蛋白样品受热再冷却溶液发生团聚，造成样液混浊，从而导致吸光度偏高，给后期亚硝酸盐的测定造成偏高的影响。而本方法加入木瓜蛋白酶后胶原蛋白被酶解，样液变得澄清，便于样液亚硝酸盐的测定，有利于实验准确度的提高。

2.2 本方法与国标法加标回收率对比

分别称取5 g样A、样B、样C、样D和样E，同时用本方法和国标法分别加入方法测定低限（1 mg/kg）、2倍方法测定低限、10倍方法测定低限的亚硝酸钠标准物质，进行加标回收实验，做6次平行实验，取平均值，其结果见表2。

由表2可知，本方法加标回收率在93.6%～97.8%，具有良好的准确度。同时，本方法回收率明显较国标法好，其原因在于国标法前处理时富含胶原蛋白的样品会出现团聚包覆，不利于亚硝酸盐的有效提取，造成加标回收率明显偏低。本方法通过加入木瓜蛋白酶对样品进行酶解，避免了团聚的发生，使得样品澄清透明，便于提取，回收率及准确度得到有效提升。

2.3 精密度实验

分别称取5.000 0 g样A、样B、样C、样D和样E，采用本方法进行6次平行实验，其结果如表3所示。经过6次平行测定，实验RSD在1.7%～4.1%，小于5.3%，满足实验技术要求，该方法具有良好的精密度。

3 結论

本实验改进了富含胶原蛋白肉制品亚硝酸盐测定的前处理，通过木瓜蛋白酶的加入，水解胶原蛋白，有效地解决了该类产品样液混浊，回收率低的检测困扰。本方法加标回收率在93.6%～97.8%，相对标准偏差在1.7%～4.1%，小于5.3%，该方法可以有效提高该类产品中亚硝酸盐含量检测的准确度。

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基金项目：食品安全监测与预警湖南省重点实验室开放基金项目（2020KFJJ11）。

作者简介：张新（1984—），男，湖南邵阳人，硕士，工程师。研究方向：食品检验与安全研究。