二烯丙基三硫醚通过调节肠道屏障缓解卵清蛋白引起的食物过敏

刘艳艳，潘礼龙，孙 嘉,*

（1.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学无锡医学院，江苏 无锡 214122）

食物过敏是机体对摄入的某些食物产生的相关不良免疫反应[1]。这种过敏性反应主要由免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介导，也有一些是非IgE介导的过敏反应，表现出胃肠道功能紊乱[1]。IgE型食物过敏主要是由食物特异性IgE抗体激活肥大细胞引起[2]。食物过敏目前是全球主要的公共卫生问题，食物过敏患病率的估测值随年龄、地理位置和研究方法的不同而变化，但总体结论是该病很普遍，并且患病率一直在增加，尤其是在某些西方国家患病率高达10%[3]。1995年，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）和联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）公布了八大类常见过敏食物，包括花生、大豆、鸡蛋、牛奶、甲壳类、鱼类、坚果和小麦，90%以上的食物过敏反应都是由这8 类食物引起的[4]。食物过敏的发病原因复杂、过敏原众多，当前针对食物过敏的主要治疗方法有避免接触食物过敏原、肾上腺素处理、抗组胺处理，以及口服和舌下免疫治疗，但长期的医药治疗给大多数患者带来厌恶或疼痛感；因此，通过食物进行免疫调节治疗成为了当前迫切的需求。

目前，研究发现IgE型食物过敏与肥大细胞、2型免疫因子等免疫系统组成密切相关。食物抗原引起的过敏主要发生在胃肠道、口腔和皮肤中，摄入的蛋白质绝大多数被胃中的胃酸和小肠中的消化酶分解，其余的食物蛋白质和多肽被肠上皮细胞（intestinal epithelial cells，IEC）和位于派尔集合淋巴结上方的M细胞从内腔转运至黏膜[5]。IEC可以处理腔内抗原，并经树突细胞（dendritic cells，DC）呈递给T细胞上的主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）II类复合物，促进原始T细胞向辅助型T2（T helper 2，Th2）细胞分化导致食物过敏[5-6]。IgE介导的过敏反应依赖于Th2细胞产生的细胞因子白细胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5和IL-13等，Th2细胞因子诱导B细胞产生抗原特异性IgE抗体。2型天然淋巴细胞（the group 2 innate lymphoid cell，ILC2）和Th2型细胞类似，可在IEC来源的IL-25、IL-33和胸腺基质淋巴生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）的作用下，产生IL-4和IL-13[7]，促进肠道上皮干细胞向杯状细胞和簇绒细胞分化以及促进肥大细胞扩增[8]。当再次接触过敏原时，IgE会和肥大细胞表面的高亲和力受体Fc受体FcεR结合，从而促进肥大细胞脱颗粒，释放组胺、白三烯等物质，引起红肿等过敏症状[9]。近年来研究发现，食品和天然材料通过免疫调节作用可以减轻过敏性疾病的症状[10]，例如Shin等[11-12]发现黄芩苷可调节Th细胞介导的免疫反应来减轻卵清蛋白（ovalbumin，OVA）引起的食物过敏症状，Huang等[13]则发现薯蓣皂苷元是通过诱导小鼠肠道中的调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）发挥抗过敏作用。

肠上皮是抵御外部环境最重要的屏障，作为选择性渗透屏障，既允许营养物质、电解质和水的吸收，又能保障对管腔内毒素、抗原和菌群有效的防御。肠上皮通过形成复杂的蛋白质-蛋白质网络连接相邻细胞并密封细胞间空间，从而维持其选择性屏障功能。肠屏障功能障碍是导致食物过敏、肠炎和腹腔疾病等疾病的主要因素[14]。在食物过敏的发病过程中，肠道通透性的增加导致完整蛋白质暴露的增加，加剧食物引起的过敏反应[5]。相反，增强肠屏障功能则可以缓解食物过敏症状，Bae等[15]发现黄芩苷可通过调节紧密连接蛋白的表达水平增强肠屏障功能，最终减弱食物过敏性免疫反应。

二烯丙基三硫醚（diallyl trisulfide，DATS）是大蒜中的主要活性成分之一，张志军等[16]利用气相色谱法测得腌制大蒜中的DATS质量浓度为416.800 μg/mL～8.335 mg/mL。研究发现，DATS可调节多种癌症发展的标志性阶段，包括细胞周期、细胞凋亡、血管生成、侵袭和转移，DATS可在细胞周期的多个阶段阻滞癌细胞，其中G2/M阻滞被最广泛报道[17]。此外，DATS也具有一定的抗炎作用，张芳等[18]在小鼠中发现DATS可以通过抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）核转移和髓过氧化物酶活性，从而对脂多糖诱导的肺部氧化损伤和炎症反应有一定的逆转作用。大蒜素为大蒜中的含硫化合物成分，赖雁威等[19]发现大蒜素可能通过干扰Toll样受体4（Toll-like receptors，TLR4）/NF-κB信号转导、抑制下游NF-κB活化、抑制炎症因子释放、恢复肠道酶活性及能量代谢、改善肠黏膜功能，从而促进慢性腹泻大鼠肠黏膜修复。但是作为大蒜素中主要成分之一的DATS对于肠道屏障的作用还鲜被研究，其对食物过敏小鼠的影响也鲜被探究。所以，本研究主要通过在小鼠食物过敏模型中灌胃补充DATS，探究其对食物过敏的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

Balb/c小鼠（5周龄，雌性）购于上海灵畅生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（沪）2018-0003，使用许可证号：0100161211000LX，在江南大学无锡医学院动物实验中心无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级屏障环境中饲养。饲养间条件：温度23～25 ℃、相对湿度40%～60%。空气交换次数10～15 次/h，光照周期明暗12 h/12 h，提供动物实验标准饲料，自由饮食饮水。

卵清蛋白、Al(OH)3、荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖（fluorescein isothiocyanate-dextran，FITC-dextran） 美国Sigma-Aldrich公司；DATS 美国Boc Sciences公司；TRIzol试剂、Super Script II逆转录酶 加拿大Invitrogen公司；SYBR Green Supermix染料 翌圣生物科技（上海）有限公司；ZO-1抗体、β-actin抗体武汉爱博泰克生物科技有限公司；ZO-2抗体 美国Proteintech公司；Occludin抗体 美国Bimake公司；Claudin-1抗体 英国Abcam公司；OVA特异性IgE（OVA specific IgE，OVA-sIgE）、小鼠肥大细胞蛋白酶1（mouse mast cell protease 1，mMCP-1）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒南京森贝伽公司；乙醇、氯仿、异丙醇 国药集团化学试剂有限公司；总RNA提取试剂盒（TRIzol法）宝生物工程（大连）有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒 上海碧云天公司；二抗（山羊抗兔IgG H&L（HRP）） 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 仪器与设备

电子分析天平 梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司；切片电子扫描仪 匈牙利3DHISTECH公司；超声波破碎仪 美国Sonics公司；高通量组织研磨机 宁波新芝生物科技股份有限公司；微型冷冻离心机、分光光度计、全波长酶标仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；Infinite M200多功能酶标仪 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 构建小鼠过敏模型

全部动物实验均由江南大学动物伦理委员会批准（实验动物伦理编号：JN.No20190630b0480830[186]），并遵循国家、国际动物实验伦理原则开展。将5周龄左右的雌性Balb/c小鼠随机分为对照组、食物过敏组（FA组）和DATS组（FA＋DATS组），每组6～8只。制备小鼠食物过敏模型的过程可分为致敏和激发两个阶段。致敏阶段：实验组分别在实验的第0天（第一次腹腔注射的时间为第0天）和第14天向小鼠体内腹腔注射0.2 mL含50 μg OVA和1 mg Al(OH)3佐剂的无菌生理盐水。激发阶段：从第28天开始，每隔1 d灌胃含50 mg OVA的无菌生理盐水进行激发，连续6 次，对照组灌胃等体积的生理盐水。FA＋DATS组每天灌胃10 mg/kg DATS溶液。最后一次经50 mg OVA（或生理盐水）灌胃1 h后，向小鼠体内注射致死剂量的戊巴比妥钠并快速收集新鲜的血液、空肠组织等，血液35 000 r/min离心10 min后吸取上清液获得血清，将血清样品和空肠组织保存于－80 ℃冰箱。

1.3.2 腹泻率与体温的监测

在造模的激发阶段，每次灌胃OVA或生理盐水30 min后记录各组小鼠的腹泻发生情况。在最后一次经50 mg OVA灌胃1 h内，每隔20 min测量各组小鼠直肠温度并记作体温。通过分析灌胃激发阶段腹泻发生率和体温下降幅度的情况判断食物过敏症状的严重程度。

1.3.3 肠道通透性的测定

肠道黏膜通透性通过FITC-dextran质量浓度来反映。将小鼠禁食4 h后灌胃500 mg/kg的FITC-dextran，4 h后处死小鼠，将血液离心后收集血清，通过Infinite M200多功能酶标仪测定吸光度（激发波长492 nm、发射波长525 nm）。将FITC-dextran标准样品在磷酸盐缓冲液中连续稀释成一系列质量浓度，测定吸光度，获得线性标准曲线方程，并计算得出血清中的FITC-dextran质量浓度。

1.3.4 小鼠空肠组织病理学检测

收集新鲜的空肠组织，经体积分数4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋后，制成5 μm厚的组织切片并进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色。经过烤片后，依次将切片放入二甲苯和体积分数70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液中后，置于HE中染色30 s，流水冲洗15 min后置于分化液中7 s，流水冲洗20 min后HE染色2 s，将切片依次置于70%、80%、95%、95%、100%的乙醇溶液及二甲苯中。使用中性树胶封片后，于显微镜下观察小鼠空肠组织病理学变化，根据肠绒毛受损情况、上皮屏障破损和免疫细胞浸润等指标对空肠组织进行评价。

1.3.5 总RNA提取与实时荧光定量PCR

利用TRIzol法根据试剂盒说明书对总RNA进行提取。空肠组织样品先在高通量组织研磨器中进行破碎，再使用氯仿进行抽提，离心后吸取上清液，加入等体积的异丙醇沉淀RNA，离心后弃去上清液，用体积分数75%乙醇溶液洗涤两次后，溶于二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate，DEPC）水中。使用Super Script II逆转录酶进行逆转录。

采用SYBR Green Supermix染料和待测基因的特异性引物（生工生物工程（上海）股份有限公司合成）进行逆转录定量聚合酶链式反应（reverse transcriptionquantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR），反应体系为：1 μL正向序列引物、1 μL反向序列引物、10 μL SYBR Green Supermix染料、2 μL cDNA、6 μL水。RT-qPCR反应程序为：95 ℃预热5 min；95 ℃持续15 s，60 ℃持续60 s，反应40 个循环。按照基因相对表达水平＝2－ΔΔCt来计算目的基因（Il-4、Il-5、Il-13、Il-25、Il-33、Tslp、Tjp1、Tjp2、Ocln、Cldn1）相对管家基因的表达量。RT-qPCR使用的引物如表1所示。

表1 RT-qPCR使用的特异性引物Table 1 Specific primers used for RT-qPCR

1.3.6 血清OVA-sIgE和mMCP-1质量浓度测定

血清OVA-sIgE和mMCP-1质量浓度按照ELISA试剂盒说明书测定。

1.3.7 Western blot分析

将空肠组织在RIPA裂解液中匀浆后于4 ℃、14 000 r/min条件下离心15 min，得到的上清液即为总蛋白提取物。利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质量浓度。蛋白样品经质量分数10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离后，电转印到硝酸纤维素膜上，经封闭后分别加一抗（ZO-1抗体、ZO-2抗体、Occludin抗体、Claudin-1抗体、β-actin抗体）4 ℃过夜孵育，用相应二抗（山羊抗兔IgG H&L（HRP））在摇床上室温孵育1 h，显色后于凝胶成像系统中曝光观察。使用AlphaView软件对条带进行灰度分析，以β-actin作为内参，通过与相应内参的灰度比计算蛋白的相对表达量。

1.4 数据统计与分析

所有结果均以平均值±标准差表示。使用GraphPad Prime 7软件进行单因素方差分析，用于评估各组之间的显著性差异。

2 结果与分析

2.1 DATS处理对小鼠食物过敏症状的影响

为了探究DATS在食物过敏中是否发挥作用，首先测定了表征IgE介导的实验性食物过敏症状的指标，包括过敏性腹泻发生率、体温下降幅度、血清中OVA-sIgE和mMCP-1的水平[20-21]。如图1A、B所示，经6 次OVA激发后，FA组小鼠与对照组相比出现腹泻的小鼠数量显著增加，小鼠体温下降幅度增加，与FA组小鼠相比，补充DATS组的小鼠则表现出腹泻发生率下降和体温下降幅度减小。

OVA诱导的小鼠食物过敏发病依赖于肠道中产生的抗原特异性IgE，从而激活下游的肥大细胞，而mMCP-1是由肥大细胞脱颗粒产生。如图1C、D所示，与对照组相比，FA组小鼠血清中OVA-sIgE和mMCP-1水平高度显著上调（P＜0.001），DATS的添加可以极显著或高度显著降低二者在血清中的水平（P＜0.01、P＜0.001）。DATS补充后可能通过调节肠道屏障功能和肠道免疫反应发挥抗过敏作用，所以接下来进一步通过HE染色观察空肠形态学变化以及利用RT-qPCR检测DATS对小鼠肠道免疫反应的作用。

由图1E可知，对照组小鼠中空肠组织形态完整，绒毛未出现脱落，固有层也未肿胀，FA组小鼠空肠组织绒毛破碎脱落，而DATS的补充可以缓解空肠组织形态的破坏，绒毛脱落得到缓解。因此，认为DATS可以缓解食物过敏的症状。

图1 DATS处理对食物过敏症状的影响Fig. 1 Effect of DATS on food allergy symptoms

2.2 DATS处理对过敏小鼠空肠组织Th2型细胞因子基因表达量的影响

食品过敏发生时，Th2型细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的水平会显著增加[22]，如图2所示，FA组小鼠空肠组织中Th2型细胞因子Il-4、Il-5和Il-13的基因表达水平高度显著上调（P＜0.001），与FA组小鼠相比，DATS处理后小鼠Th2型细胞因子基因的表达水平极显著下调（P＜0.01）。结果表明灌胃补充DATS后可以通过调节免疫反应抑制Th2型细胞因子的产生，DATS可能在小鼠肠道中发挥免疫调节功能。

图2 小鼠空肠组织中Il-4（A）、Il-5（B）和Il-13（C）的表达水平Fig. 2 Il-4 (A), Il-5 (B) and Il-13 (C) expression levels in mouse jejunum tissue

2.3 DATS处理对肠道上皮细胞因子基因表达量的影响

在食物过敏的早期，肠道上皮来源的IL-25、IL-33和TSLP表达量增加，可以促进Th2型细胞和ILC2产生Th2型细胞因子IL-4、IL-5和IL-13[23]。由于检测到当补充DATS后，Th2型细胞因子表达量下降，所以测定了小鼠空肠组织中Il-25、Il-33和Tslp基因水平的变化。如图3所示，FA组小鼠与对照组小鼠相比，空肠中肠道上皮细胞因子Il-25、Il-33和Tslp的基因表达水平均极显著或高度显著上调（P＜0.01、P＜0.001），而在补充DATS后，Il-33、Tslp表达水平无显著变化，Il-25基因表达水平极显著下降（P＜0.01），这提示DATS可能通过抑制IL-25的产生缓解食物过敏。以往研究发现，IL-25在小鼠肠道中仅由一种特定的上皮细胞簇状细胞产生[24]，并且观察到DATS补充后可以有效缓解肠道上皮细胞受损，所以猜测DATS补充后可能通过调节肠道上皮细胞来源的IL-25水平发挥抑制Th2型免疫反应的作用。

图3 小鼠空肠组织中Il-25（A）、Il-33（B）和Tslp（C）表达水平Fig. 3 Il-25 (A), Il-33 (B) and Tslp (C) expression levels in mouse jejunum tissue

2.4 DATS处理对过敏小鼠肠道屏障作用的影响

肠道屏障功能对维持体内平衡非常重要，屏障功能的破坏会导致肠道疾病，如肠漏综合征、炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）和食物过敏[15,25]。有研究表明，食物过敏小鼠的肠道屏障会受损，肠道通透性增加[26]。通过灌胃FITC-dextran检测小鼠空肠黏膜通透性，结果如图4所示。与对照组小鼠相比，FA组小鼠血清中FITC-dextran质量浓度高度显著增加（P＜0.001），而FA＋DATS组小鼠与FA组小鼠相比，血清中FITC-dextran质量浓度高度显著降低（P＜0.001）。此外，通过检测肠上皮中紧密连接蛋白及相关基因Claudin-1（Cldn1）、Occludin（Ocln）、ZO-1（Tjp1）和ZO-2（Tjp2）的表达，探究DATS是否能调节小鼠食物过敏模型中的肠屏障功能。和预期结果一样，FA组小鼠与对照组小鼠相比，Occludin、ZO-1和ZO-2的表达在基因水平和蛋白水平上均显著降低（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001），而在补充DATS后，与FA组相比，这些紧密连接蛋白的表达水平则上调。这些结果表明紧密连接蛋白表达水平的增强可能有助于减轻食物过敏。因此认为DATS可能通过提高紧密连接蛋白的表达水平来抑制食物过敏原如OVA在肠道屏障中的渗透。

图4 小鼠肠道屏障紧密连接蛋白表达量的变化Fig. 4 Changes in intestinal epithelial tight junction protein expression in mice

3 讨 论

本研究发现DATS可通过调节紧密连接蛋白的表达增强肠道屏障功能减轻食物过敏免疫反应。本实验选择大蒜素的主要活性成分之一DATS作为大蒜有机硫化物的代表成分，探究其是否对食物过敏小鼠发挥保护作用。首先通过在食物过敏小鼠中灌胃DATS发现食物过敏小鼠中出现的腹泻、体温降低以及血清OVA-sIgE和mMCP-1水平上调等症状均表现出减轻现象，表明添加的DATS可能在食物过敏中发挥保护性作用。

进一步探究DATS对空肠中Th2型细胞因子的调节作用以及对肠道紧密连接蛋白的调节作用，发现DATS可通过降低空肠组织中Th2型细胞因子水平发挥保护性作用，并上调紧密连接蛋白的表达增强肠道屏障功能减弱食物过敏症状。Xu Yi等[27]利用巨细胞病毒（cytomegalovirus，MCMV）感染小鼠后发现Th1型细胞因子和T-bet（T-box基因家族的转录因子）的表达显著下调，而GATA-3（GATA基因家族的转录因子）和Th2型细胞因子的表达量显著上调，但是当使用大蒜素处理后发现，转录因子GATA-3和Th2型细胞因子的表达量显著降低。宿主为应对食物抗原等产生Th2型免疫反应，该反应不仅涉及DC、T细胞和B细胞等多种免疫细胞，而且涉及非免疫细胞上皮细胞等，其中CD4＋T细胞发挥关键作用。原始CD4＋T细胞可分化为至少4种类型的Th细胞，即Th1、Th2、Th17和Treg，其中Th2型细胞对于宿主抵抗细胞外寄生虫（例如蠕虫）的入侵以及减轻哮喘和其他过敏性炎症（如食物过敏）的发展具有重要作用。Th2细胞通过产生各种细胞因子来发挥功能，包括IL-4、IL-5和IL-13等。主要由Th2型细胞分泌的IL-4和IL-5作为过敏性疾病的主要介质，在过敏免疫反应中起着关键作用，不仅诱导CD4＋T细胞从原始T细胞向Th2细胞分化，而且诱导B细胞的增殖、分化和激活，从而产生IgE[15]。分泌抗原传递（secretory antigen passages，SAP）通过IL-13-CD38-环状二磷酸腺苷核糖（cyclic adenosine diphosphate ribose，cADPR）依赖性过程将食物过敏原引导至固有层黏膜肥大细胞，食物过敏原可通过IL-13/CD38/cADPR途径介导通过小肠上皮细胞，调节食物过敏反应的发生[28]。此外，IL-13在食物过敏中对于肠道上皮干细胞向杯状细胞和簇状细胞的转变也非常重要[20]。因此，认为DATS的补充可以显著下调空肠组织中Th2型细胞因子的表达水平，可能是通过调节肠道中Th2型免疫反应抑制细胞因子的产生实现的[29-30]。

近来人们越来越关注由上皮细胞衍生的细胞因子IL-33、IL-25和TSLP引起的2型免疫应答。Leyva-Castillo等[8]证明胶带剥离引起角质形成细胞释放的IL-33与肠道簇状细胞衍生的IL-25协同作用，可促进肠道ILC2的增殖和激活，从而促进IL-4的产生，引起肥大细胞在肠道中的激活，从而加剧过敏性皮炎引起的食物过敏反应。而TSLP可以上调树突状细胞上共刺激分子OX40L、CD80和CD86的表达，这是T细胞向Th2型极化所必需的[31]。本实验通过测定肠道上皮细胞因子Il-25、Il-33和Tslp基因表达水平，确定DATS可能通过降低IL-25水平而发挥保护性作用。

IL-25在肠道中的唯一来源是肠道上皮细胞中的簇状细胞，源自簇状细胞的IL-25可以进一步激活ILC2分泌IL-13，介导小肠中的2型免疫相关反应[32-24]。Hussain等[33]发现高脂饮食会破坏肠道屏障，降低紧密连接蛋白的表达，从而促进食物过敏的发生。食物过敏的小鼠肠道屏障完整性的改变与Occludin、Claudin-1、ZO-1、ZO-2表达水平的降低有关[34-35]，所以本实验分别利用RT-qPCR和Western blot检测了其在基因和蛋白水平表达的差异，结果表明，补充DATS后可上调空肠组织中紧密连接蛋白ZO-1、ZO-2以及Occludin的表达，有效缓解肠道屏障损伤，增强肠道屏障功能，从而缓解食物过敏症状。

综上，食物来源大蒜素的有效活性成分DATS可恢复肠道屏障，从而改善了OVA诱导的食物过敏反应。因此，DATS有潜力作为抗过敏剂用于预防或治疗食物过敏。