新型体外产气法（非瘤胃液）的建立及对两种预处理玉米秸秆饲用价值的评估

■肖 雷 顿耀豪 杨 曼 胡 迪 梁运祥

（华中农业大学生命科学技术学院，农业微生物学国家重点实验室，湖北 武汉 430070）

我国是农业大国，主要农作物秸秆资源总量为7.9 亿吨/年[1]。秸秆含有反刍动物所需的多种养分，玉米秸秆随收获时间的不同，其组成成分存在一定差异[2]，一般而言含粗纤维31%～41%、中性洗涤纤维约80%、酸性洗涤纤维约53%、蛋白质3%～5%、脂肪0.5%～1%，为饲料化利用奠定了物质基础[3]。然而目前秸秆饲料化利用率不足20%，超过60%被废弃或直接粉碎还田，有效利用率尚有巨大提升空间[3-4]。此外，秸秆中的主要成分为木质纤维素，而木质素和半纤维素以酯键、醚键、糖苷键和缩酸等共价键连接形成的镶嵌结构复合体会对纤维素形成“保护”屏障，阻碍瘤胃微生物和消化酶对秸秆中纤维组分及其他细胞内容物的利用[5]，导致直接饲喂在瘤胃内的降解率不足50%[6-7]，因此研发适当的预处理工艺在提高秸秆饲用价值上十分必要。在反刍动物饲用价值的评估方法中，瘤胃液体外消化[8-9]与半体内消化[10-12]是两种常见的方法，已被广泛应用于学术研究和生产实践中。然而这两种方法瘤胃液取样繁琐，造瘘成本高昂，无法满足大批量的评估需求。而瘤胃液作为体外产气试验中微生物菌群的来源，一直以来被认为是形成数据波动和误差的重要原因，Cantet 等[13]研究表明即使在启动正式试验前增加瘤胃液的“预孵育”环节，也并不能起到预期的对瘤胃液进行均一化的效果。为了摆脱对瘤胃液的依赖，不少学者提出用动物粪便代替瘤胃液，Váradyová等[14]以美利奴羊粪便作为接种物发现粪便的产气速率和产气总量低于瘤胃液而不足以胜任，Zicarelli 等[15]却在羊源粪便上得出相反的结论，认为粪便可以作为瘤胃液的有效替代物。上述研究表明动物粪便作为体外产气试验的接种物时同样缺乏稳定性。因此本研究提出了用驯化后的厌氧污泥替代瘤胃液的新型体外产气法，对该方法的操作参数和条件进行了说明和优化，然后以此分别评估了两种处理后的玉米秸秆，并采用二硝基水杨酸（DNS）和高效液相色谱（HPLC）法对结果进行比较分析，为体外评估木质纤维原料在反刍动物中的饲用价值提供新的借鉴思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉米秸秆：来源于江苏连云港2018 年秋收玉米秸秆，经晒干后截短并机械粉碎，过筛保留尺寸10～40目的秸秆粉，常温储藏。

厌氧污泥：来源于某市政污水缺氧池污泥（市政污泥）与某酵母工厂发酵废水厌氧池污泥（工厂污泥），取样后4 ℃保藏，7 d内用于试验。

1.2 试验方法

1.2.1 秸秆预处理

秸秆经两种方法（PTⅠ、PTⅡ）预处理后，一部分直接烘干保存，另一部分用5倍及以上秸秆质量的水浸洗后再烘干待用。

1.2.2 酶解糖测定

准确称取105 ℃干燥后的秸秆样品0.5 g至100 mL瓶中，加入50 mL配置好的含酶缓冲液，50 ℃100 r/min条件下振荡酶解72 h。每次酶解设置不加秸秆的空白组以去除纤维素酶带入糖的影响。将酶解后的样品稀释一定倍数，用DNS 法测定还原糖的含量，或采用HPLC检测葡萄糖和木糖含量。

含酶缓冲液配置：将纤维素酶与半纤维素酶按4∶1（W/W）比例混合均匀，取7.5 g 混酶加入250 mL乙酸-乙酸钠缓冲液，缓冲液浓度为0.2 mol/L，pH 为4.8。振荡30 min使纤维素酶及半纤维素酶溶解后过滤，纯化水冲洗残渣，收集滤液加水至990 mL，加入10 mL 1%的叠氮化钠和0.1 g青霉素钠后混匀。

1.2.3 体外产气系统搭建

在体外搭建厌氧消化系统，需要关注3个部分：厌氧污泥的活性、厌氧消化环境的稳定及CH4数据的监测。

厌氧污泥由丰富的微生物菌群组成，其活性也与之息息相关。微晶纤维素作为纤维素标准品，其结构与秸秆的可发酵成分相似，可以作为驯化底物；此外微晶纤维素的分子式（C6H5O10）确定，可通过Buswell方程计算出理论产CH4量[16]，单位为mL CH4/g VS（挥发性固体，volatile solids）。

式中：a——碳的系数（CaHbOc）；

b——氢的系数（CaHbOc）；

c——氧的系数（CaHbOc）。

因此，微晶纤维素的理论产CH4量为414 mL/g VS，可以通过实际产气和理论产气的差距判断厌氧污泥的活性。故以微晶纤维素为底物，首先对两种不同来源的厌氧污泥（市政污水缺氧池污泥与酵母发酵废水厌氧池污泥）的厌氧消化活性进行筛选，之后对更优来源的污泥进行多轮驯化，当CH4产气量达到理论产气量的80%时，即获得驯化后的高活性厌氧污泥。

厌氧消化环境的稳定性包括厌氧度、温度和传质效果。试验开始前，将装料后的反应器依次通过高纯氮气洗刷顶空，以除掉氧气和保证启动时的厌氧度；整个试验周期，反应器都置于水浴锅中以维持恒定温度；每个反应器的顶部都装有一个搅拌电机，其连接的搅拌轴具有一定的弯曲角度但无搅拌桨叶，搅拌部件通过“手套箱”的原理与反应器相连以此保证密封；搅拌电机设置为间歇工作模式。单个反应装置的体积为600 mL，工作体积为400 mL，具体如图1所示。

图1 厌氧消化反应器

CH4产气量由全自动甲烷潜力测试系统（RTK BMP）实时监控，其原理是将反应器实时产生的CH4先通过NaOH溶液吸收完毕其中的CO2，然后将剩下的CH4经过计量单元，CH4在计量单元中形成依次释放的大小恒定的气泡，每个气泡代表准确标定的体积值，通过记录气泡数即可得到CH4气体体积。该设备可自动扣除初始纯氮气顶空对数据造成的偏高的影响。

综上所述，厌氧消化系统操作方法为：以微晶纤维素为底物，经多轮驯化获得高活性厌氧污泥；取适量驯化后的厌氧污泥和待测样品，通过马弗炉测定VS；取适量微晶纤维素105 ℃烘干至绝干；将5～10 g样品分装至反应器中，再添加相应的厌氧污泥，最后补水至总质量为400 g；起始pH 范围为7.5～8.2；空白对照，分装等量污泥和水；阳性对照，用5～10 g微晶纤维素替代样品；给反应器装好搅拌轴，通入高纯氮气5 min，排空顶部空气；接通全自动CH4潜力测定仪，设置搅拌模式为连续搅拌，待水浴锅升温至目标温度，启动试验；测试过程保持水浴锅水位与反应器中液位基本持平。

?1.3 试验设计

1.3.1 体外产气系统条件优化

由于秸秆的均一性较差，会导致CH4产量波动较大，使得组间差异不明显；而微晶纤维素与纤维素结构类似，其理论产CH4也能计算得出（414 mL/g VS），常作为CH4潜力测试中的阳性对照[17]。因此，微晶纤维素更适宜于作为厌氧消化条件优化试验的发酵底物。

以微晶纤维素为底物分别对温度、接种物与底物比例（inoculum to substrate ratio，iSR）（以VS 质量比计）和碳酸氢钠添加量进行单因素优化。发酵初始条件如表1所示，每隔24 h记录CH4产量。

表1 体外产气条件优化试验设计

1.3.2 体外产气系统评估玉米秸秆消化性能

以PTⅠ-水洗秸秆、PTⅠ-未水洗秸秆、PTⅡ-水洗秸秆、PTⅡ-未水洗秸秆和未处理秸秆5 种原料为底物进行厌氧消化，厌氧消化条件为：55 ℃、ISR=2、不添加碳酸氢钠。同时，分别使用DNS法和HPLC法测定未处理和两种预处理秸秆（未水洗）的酶解糖含量。

2 结果与分析

2.1 厌氧污泥驯化（见图2）

对酵母发酵废水厌氧池污泥（工厂污泥）和市政污水缺氧池污泥（市政污泥）发酵微晶纤维素产CH4量进行比较，结果如图2所示，市政污泥的CH4累积量始终显著低于工厂污泥（P＜0.05）。并且，随着不断地使用微晶纤维素驯化，工厂污泥的累积产CH4量从初始的193.2 mL/g VS提升到六轮次驯化后的363.9 mL/g VS，提高了88.4%。这表明经驯化后的厌氧污泥中的菌群已经适应了以微晶纤维素作为单一碳源进行厌氧消化，适合作为后续条件优化的接种物。

图2 不同来源污泥和驯化次数对微晶纤维素CH4发酵的影响

2.2 体外产气系统条件优化（见图3）

图3A 结果表明55 ℃的高温厌氧消化相较于35 ℃的中温厌氧消化CH4产生速率和产量都明显提高，55 ℃消化时第1天便开始启动发酵，而35 ℃消化时第4 天才观测到CH4的积累，表现出较长的停滞期。如图3A所示，9 d的厌氧消化周期内ISR值为2和3时CH4的累积曲线展现出相同的趋势，最终CH4总产量无显著差异（P＞0.05），但与ISR 值为1 相比，CH4产量提高了11.9%，且在前5 d 内ISR 值为2 和3 时CH4产率与ISR 值为1 时的CH4产率差距更大，因此在后续试验中选择的最佳ISR值为2。

图3B结果表明不同碳酸氢钠添加量组（0、2、4 g）之间的CH4产率和产量没有显著区别（P＞0.05），说明碱度在本试验中不是限制因素。

图3 不同温度和ISR（A） 及碳酸氢钠添加量（B）对微晶纤维素CH4发酵的影响

2.3 预处理秸秆的体外产气评价（见图4）

图4 水洗前后PTⅠ秸秆（A）和PTⅡ（B）CH4发酵情况

秸秆预处理后纤维组分被破坏，微生物对其可降解性增强，必然会反映在厌氧消化的CH4产量上。图4结果显示经PTⅠ和PTⅡ处理的秸秆7 d内CH4产量和产率较未处理秸秆都明显提高，PTⅠ-未水洗秸秆7 d的CH4产量为160.8 mL/g VS，较未处理秸秆的CH4产量112.3 mL/g VS提高了43.2%；而PTⅡ-未水洗秸秆7 d 的CH4产量为243.4 mL/g VS，较未处理秸秆的CH4产量159.0 mL/g VS 提高了53.1%。从7 d 的CH4总产量上看，PTⅡ秸秆可消化性较PTⅠ秸秆提高幅度更大，反映出PTⅡ处理较PTⅠ处理有更好的预处理效果。

图4B显示了PTⅡ-水洗秸秆、PTⅡ-未洗秸秆及原料秸秆在厌氧污泥系统中7 d 的产CH4情况，从发酵第1 天开始无论水洗还是未水洗的PTⅡ秸秆产CH4量始终高于未处理秸秆，说明PTⅡ秸秆更易被厌氧微生物分解利用。秸秆经预处理后木质纤维结构打开，会产生有机酸、低聚糖及其他可溶性成分，水洗后这些易消化产CH4的成分部分流失，木质纤维素“浓缩”，可发酵性降低、产气量降低，所以水洗秸秆产气量始终低于未水洗秸秆，以致发酵7 d 时产CH4量较未水洗秸秆低9.5%。图4A 显示的PTⅠ秸秆水洗前后产CH4情况与PTⅡ秸秆水洗前后产CH4趋势一致，但7 d时产CH4量较未水洗低17%。

2.4 秸秆预处理效果评估方法对比（见表2）

表2 DNS法、HPLC法及厌氧消化法3种方法比较预处理效果

表2 展示了DNS 法、HPLC 法和体外产气法对秸秆预处理效果的评估结果，预处理对秸秆消化率的提升均能在3种方法中得到体现。从提高率上看，3种方法皆显示出PTⅡ效果优于PTⅠ，反应出新方法在评估秸秆预处理效果优劣方面与传统方法具有一致性。此外，通过CH4产量对应的葡萄糖当量数据，可以折算为体外条件下，PTⅠ和PTⅡ处理过的秸秆消化净能分别约等于0.39 g和0.50 g葡萄糖消化净能，更加直观地体现出预处理环节对秸秆价值释放的必要性。

3 讨论

3.1 厌氧污泥采集与驯化

厌氧污泥应选择长期平稳运行的污水处理厂，以保证微生物菌群的活性与稳定。一次性可采集足够用于大批量试验的接种物，但应对污水系统稳态无不良影响（如本次试验单次采集了50 kg，TS约10%的厌氧污泥）。采集池或罐底部污泥，直接装入可密封的容器，无需专用工具，无需刻意保持全程无氧，常温储存，相较于瘤胃液采集更加便捷。

厌氧污泥的活性是厌氧消化过程的关键，而不同来源的厌氧污泥，其微生物菌群结构存在较大差异[18]，从而影响了木质纤维素的降解效果[19]。在驯化试验中，市政污泥的CH4累积量始终显著低于工厂污泥，可能是因为酵母发酵废水中含有更加丰富的微量元素和更加均衡的营养物质，使工厂污泥富集出了性能更加优异的厌氧消化菌群。此外，微晶纤维素的理论CH4产量为414 mL/g VS，经多轮次驯化后的工厂污泥对微晶纤维素的转化率达87.7%，与Raposo 等[17]报道的85%转化率基本相符，表明厌氧污泥的驯化已达到预期目标。

3.2 体外产气系统条件优化

之前的研究表明，与中温厌氧消解相比，高温厌氧消解的反应器中含有更多的木质纤维素降解微生物，使其产CH4速率更快[20]，但中温和高温消化最终CH4总产量基本保持一致。虽然瘤胃温度在39 ℃左右，远低于高温厌氧消化的55 ℃，但作为一个体外评价方法，在保证数据稳定且可靠的前提下，还要综合考虑获得数据所需要的时间，因此确定以55 ℃作为体外厌氧消化的最佳温度。

Feng 等[21]观察到ISR 为1 时，在醋渣的厌氧消化试验过程中CH4产率最高，而Kawai 等[22]在消化厨余垃圾的过程中发现ISR 为3 时，观测到最高的CH4产量。本研究和这些学者研究结果的差异说明最佳ISR可能会随着所消化底物类型改变而变化，易消化的厨余垃圾更容易积累VFAs，所以依赖更高的ISR。

不同碳酸氢钠添加量组对产CH4结果无显著影响，可能是所提供的厌氧污泥自身具有一定的pH 缓冲能力，而微晶纤维素作为一类缓释碳源，在厌氧消化时也不容易降解，中间产物VFAs 的积累没有造成pH大幅下降至最适范围之外。

综上所述，厌氧消化的最优条件是：55 ℃、ISR=2、不添加碳酸氢钠。

3.3 预处理秸秆体外产气系统评价

通常秸秆在瘤胃内的停留时间在72 h左右[23]，玉米秸秆NDF 含量70%左右，NDF 体内消化率约50%～60%[24]，则推算瘤胃有效消化率为30%～35%[4]，假设消化部分主要为纤维素和半纤维素，则其产CH4量为120～145 mL。如图4B 所示，PTⅡ处理秸秆和未处理秸秆3 d 厌氧消化产CH4量分别为202.5 mL/g VS 和132.0 mL/g VS，处理后产CH4量较处理前高53.41%，且产CH4量分别达到总产CH4量的83.20%和83.02%（以7 d为发酵终点，PTⅡ处理秸秆和未处理秸秆总产气量分别为243.4 mL/g VS和159.0 mL/g VS），说明预处理不仅能增加秸秆产CH4潜力，还可以提高其产气速率，且3 d厌氧消化产CH4量可以大致预测瘤胃消化率。

传统体外产气法通常监测的数据为总产气体积，将本研究的玉米秸秆原料产甲烷数据折算成干基总产气量（其中CO2含量按40%～50%折算，灰分按干基的10%计）则为198～237.6 mL/g（干基），与国内外其他学者的数据194.9～242 mL/g（干基）相近[25-28]。然而韩肖敏等[29]和冉生斌等[30]分别以阉牛和小尾寒羊作为瘤胃液的采集供体，开展传统体外产气试验用于评估玉米秸秆，2 d累积总产气量却分别只达到152.3 mL/g（干基）和142.9 mL/g（干基），显著低于其他文献的范围。上述来自不同团队的数据差异较大，表明传统体外产气法依赖于新鲜瘤胃液作为接种物，因而受限于供体对象的种类及健康状态和取样过程的设备及人员的专业程度，既难以开展大规模的同批次试验，又往往因不同批次的数据波动较大而无法横向比较。

此外，传统体外产气法普遍会监测挥发酸组成及变化，以期获得更详细的体外消化数据。但体外模拟环境在两个方面和体内条件存在显著差异：①无法模拟上皮细胞对挥发酸的直接吸收；②无法模拟反刍带来的氧化还原电位周期性的波动。前者可能直接影响参与挥发酸代谢的菌群结构，而后者则会对整个瘤胃菌群的组成造成扰动。因此，传统体外产气在消化方面的数据与体内实际情况可能相去甚远，重点关注产气数据对于粗饲料原料的饲用潜力的评估意义更大。

3.4 秸秆预处理效果的3种评估方法比较

表2 显示，3 种方法虽然在秸秆预处理效果评估都能分清优劣，然而相较于原料秸秆，3种方法体现的酶解糖提高率和CH4产量提高率却大相径庭。分析可能的原因如下：

①DNS 法测得的还原糖含量与HPLC 法测得的总糖（葡萄糖和木糖）含量差距较大，其中HPLC 法计算的是葡萄糖和木糖含量之和，略低于实际酶解糖量；而DNS法测得的还原糖会因酚类（来源于本研究所采用的预处理过程）等具有还原性羟基的物质存在高于实际酶解糖量，这两种测糖方法本身就有一定局限性。

②秸秆中还有部分非纤维组分的有机物（如蜡质和蛋白质），厌氧消化时能够贡献CH4，而酶解糖中并没有这部分含量，所以表2中3 d厌氧消化CH4产量的葡萄糖当量要高于HPLC 法和DNS 法测得的糖含量，因而CH4产量提高率远低于酶解糖提高率。

③以原料秸秆3 d厌氧消化CH4产量为121.4 mL/g VS 计，相当于323 mg 葡萄糖，与报道中秸秆40%～50%消化率（消化降解的木质素不产气）结果相近[6-7]。而HPLC 法和DNS 法测得的总糖和还原糖含量分别为111.9 mg/g和166.1 mg/g，远低于323.0 mg/g的葡萄糖当量。即使秸秆中除木质纤维素和灰分外所有12%有机成分优先产CH4，HPLC 法和DNS 法的葡萄糖当量也不到300 mg/g，则以酶解糖含量估算原料秸秆消化率和消化能结果会明显偏低。说明在多菌群协同作用下，木质纤维素的厌氧消化速率远高于单一纤维素酶酶解的速率，而多菌群协同作用促进木质纤维素消化正是瘤胃中存在的真实情况。

综上所述，体外产气与瘤胃消化过程类似，相当于在体外构建了一个多菌协同、菌酶协作的厌氧体系，并用CH4产气量表征了VFAs 在瘤胃内被直接吸收的情况，因此体外产气法较酶解法更适合评估秸秆等木质纤维素原料的瘤胃消化率。体外消化率与瘤胃真实消化率差异主要与体外产气截止时间的选择有关，即两者消化速率不同，两者产率不一致。但就体外消化3 d 快速产气阶段而言，两者趋势应当是一致的。因此，3 d 体外消化虽不能精确表示真实消化率，但可以大致反映瘤胃消化情况，足以准确反映不同秸秆原料瘤胃消化率差距，适用于处理前后秸秆消化率和消化能提升效果评估。同时，相较于传统的体外产气试验，本方法摆脱了对新鲜瘤胃液的依赖，重复性更好，且更易于大批量操作。但需指出的是，传统体外产气试验经过长年的、广泛的应用，发展出了一套完整且严格的操作过规范，而本方法虽然在本研究过程中实现了稳定的、可重复的结果，但在相关实施细节上还需要更加全面的数据支撑，如污泥来源的选择标准、污泥驯化成功与否的评判指标、产气试验的其他影响因素的分析等。

4 结论

本研究提出了以3 d厌氧消化产CH4量为指标进行反刍动物饲用秸秆预处理效果评估的方法，对厌氧消化条件进行优化，并对PTⅠ和PTⅡ处理秸秆及未处理秸秆进行厌氧消化产CH4量进行比较，得到以下结果：

以微晶纤维素为发酵底物筛选出多轮驯化后的工厂污泥作为接种物，进一步优化得到最适厌氧消化条件为55 ℃、ISR=2、不添加碳酸氢钠，在该条件下能够稳定实现3 d内纤维原料产气潜力的充分释放。

预处理后秸秆产CH4潜力和产CH4速率都有提高，水洗后产CH4潜力和产CH4速率较水洗前有所降低，PTⅡ处理对体外产气没有抑制作用。

PTⅠ和PTⅡ分别可使秸秆厌氧消化3 d 产CH4量提高19.4%和53.4%，据此可推算每克秸秆经PTⅡ处理后瘤胃消化净能约等于0.50 g葡萄糖消化净能。

体外产气过程可大致模拟瘤胃消化情况，以驯化后的厌氧污泥代替新鲜瘤胃液作为接种物进行3 d体外厌氧消化产CH4试验，是一种评估反刍动物饲用秸秆预处理效果的可行方法。并且与传统的体外消化（瘤胃液发酵试验）和体内消化（瘤胃真实消化）相比，该方法无需依赖动物模型且稳定性好，批次处理量大，易于推广。但是新方法后续仍需要更加广泛而全面的试验数据，来形成普遍适用的操作规范，为科学研究和实际生产提供新的可选方案。