多柔比星致小鼠慢性心脏毒性模型的构建及评估

金翠柳 ,柴 钰 ,凌 望 ,吴美平 ,金素安

(1.上海中医药大学附属市中医医院,上海 200071；2.上海中医药大学,上海 201203)

肿瘤心脏病是临床影响肿瘤患者生存率的一类重要疾病,尤其是放疗或化疗药物诱发的心脏毒性最为常见,其中化疗药物诱发心脏毒性在抗癌治疗中发病率高,常常影响肿瘤患者的预后,是妨碍肿瘤幸存者生命健康的一大挑战[1-4]。目前针对化疗药物诱发的心脏毒性尚无明确的治疗措施,建立可靠的心脏毒性模型是进行药物研究的前提。构建心脏毒性模型多采用放疗或化疗药物进行干预,化疗药物干预常以多柔比星药物腹腔注射构建心脏毒性模型较为常见[5-6]。且采用药物注射操作技术简便、易于大量重复,是目前探索肿瘤心脏病治疗方法的合适动物模型。

构建多柔比星诱导小鼠心脏毒性模型是心血管基础研究常用的动物模型之一[7-8],也是探索肿瘤心脏病的病理发生、发展以及治疗方法的前提,然而通过查阅国内外相关文献发现,构建心脏毒性模型采用的多柔比星药物浓度差异较大,给药策略和评价指标不规范,给药浓度从3～10 mg/kg 均有涉及,其中有采用多柔比星给药浓度3 mg/kg,隔天给药1 次,给药2 周来构建该模型,以小鼠心超指标:左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)下降为建模成功指标[9]。也有采用4 mg/kg 多柔比星药物浓度连续注射4 周,以血清中肌钙蛋白T(cTnT)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶-同功酶(CK-MB)等指标上升视为建模成功指标[10]。更甚者提出在第1、3、5 天给予多柔比星10 mg/kg 腹腔注射,1 周后也可检测到小鼠心功能下降,心肌细胞凋亡[11],综合上述发现该模型对于造模用药剂量、时间差异极大,且目前国内外研究对多柔比星构建心脏毒性模型以何种浓度诱导,以及诱导的时间长短均无定论[12-14]。本研究通过参考临床多柔比星化疗方案[15-16],并结合多柔比星药代动力学特征,多柔比星血浆浓度呈多相衰减,终末相半衰期为50 h[17],探讨在同等的造模时长(4 周)、给药周期(每3 d 1 次)下系统地探讨不同浓度多柔比星对小鼠心脏损伤、心脏组织结构变化的影响,以期构建出成模率高且死亡率低的多柔比星慢性心脏损伤模型,为后续开展多柔比星相关实验的广大研究者提供造模参考依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF 级别实验雄性小鼠C57BL/6J,36 只,20～22 g,6～8 周龄,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[SCXK(沪)2017-0005],在上海同济大学实验动物中心[SYXK(沪)2018-0034]SPF 屏障环境(室温20℃～25℃,湿度60%～70%)下饲养。实验经上海同济大学生物医学伦理委员会审批(TJHBLAC-2019-057)。实验过程遵循3R 原则。

1.2 主要试剂

盐酸多柔比星(Med Chem Express,美国；批号:HY-15142)；活化后的半胱氨酸蛋白3(Cleavedcaspase-3)(CST,美国；批号:9664S)；促凋亡蛋白(Bax)(CST,美国；批号:ab182734)；抑凋亡蛋白(Bcl2)(CST,美国；批号:ab182858)；抗-甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(CST,美国；批号:5174S)；山羊抗兔 IgG (H+L) (Yeasen,中国；批号:33101ES60)；天狼猩红染色试剂盒(索莱宝科技有限公司,中国；批号:S8060)；麦胚凝集素染色试剂盒(Thermo,美国；批号:L2785)。

1.3 实验方法

1.3.1 造模

8 周龄SPF 级别雄性C57BL/6J 小鼠36 只,将其随机分为NS 组、3 mg/kg 多柔比星剂量组、4 mg/kg 多柔比星剂量组、5 mg/kg 多柔比星剂量组、6 mg/kg 多柔比星剂量组、7 mg/kg 多柔比星剂量组,每组各6 只。实验小鼠根据分组腹腔注射不同浓度多柔比星和生理盐水,每3 d 1 次,共10 次。30 d后,处死小鼠,取出心脏,用于后续实验。

1.3.2 检测指标及方法

(1)HE 染色

参照文献[18],常规脱蜡至水后,按说明书使用伊红-苏木素染料进行染色,心脏组织常规脱水透明后进行封片处理,在显微镜下观察组织显色效果并采集图像。

(2)天狼猩红染色

参照文献[19],常规脱蜡至水后,准备湿盒,用免疫组化笔在组织周围画圈,按说明书使用天狼猩红染料进行染色,心脏组织常规脱水透明后进行封片处理,在显微镜下观察组织显色效果并采集图像。

(3)麦胚凝集素染色

参照文献[20],烤片,脱蜡至水,使用微波炉将组织用柠檬酸钠修复液进行抗原热修复,甘氨酸室温孵育20 min,用PBS 洗1 次。准备湿盒,用免疫组化笔在组织周围画圈,按说明书要求进行麦胚凝集素染色,染色完成后使用荧光显微镜观察组织显色效果并采集图像,后续使用Image J 软件统计心肌细胞横截面积。

(4)蛋白免疫印迹(Western blot)

称取并研磨相同重量的心脏组织,裂解并提取蛋白,测定蛋白浓度。蛋白样品进行电泳、转膜、封闭,后续加入一抗GAPDH、Bax、Bcl2、Cleavedcaspase3 和相应二抗孵育,Bio-Rad 凝胶成像分析仪曝光,Image J 统计各组灰度值。

1.4 统计学方法

采用Graph Pad Prism 6.0 统计软件进行统计学分析,实验数据以平均数±标准差()表示,对各项指标数据进行正态性检验,其中多组间比较用One-Way ANOVA 分析法,多组间两两比较采用Dunnett-t检验,两组间均值差异采用两独立样本t检验,以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度多柔比星对小鼠一般情况及生存率的影响

与NS 组相比,6 mg/kg 多柔比星模型组小鼠存活5 只,7 mg/kg 多柔比星模型组小鼠存活1 只,其余浓度模型组小鼠均存活,提示小鼠生存率随着多柔比星的浓度增加而同步下降,见图1A。取材后对各组小鼠心脏拍照观察,发现随着多柔比星浓度的上升,小鼠心脏呈剂量依赖性的缩小,见图1B。同时对小鼠心脏中段横截面进行HE 染色,从图1C 可见,与生理盐水组相比,多柔比星组小鼠心脏整体缩小,心室内径扩大,与肉眼观察相符。后期对小鼠的体重、心脏重量、心重比及其心胫比进行统计,发现与NS 组相比,多柔比星组小鼠的体重、心脏重量、心胫比均下降,且随着多柔比星浓度的增加而同步下降(P＜0.05),但在小鼠心重比参数上无统计学差异(P＞0.05),可能与多柔比星注射后体重同步下降有关,见图1D～1G。

图1 不同浓度多柔比星对小鼠一般情况及生存率的影响(n=6)Note.A,Mouse survival curve.B,Pictures of representative hearts of mice in each group.C,Schematic diagram of HE staining of mice in each group.D,Body weight statistics of mice in each group.E,Heart weight statistics of mice in each group.F,Statistics of the ratio of heart to body weight in each group.G,Statistics of the tibia heart weight ratio of mice in each group.Compared with normal saline group,***P＜0.001,**P＜0.01,*P＜0.05,nsP ＞0.05.Figure 1 Effects of different concentrations of doxorubicin on general condition and survival rate of mice

2.2 不同浓度多柔比星对心肌细胞凋亡的影响

心肌细胞凋亡是多柔比星诱导心肌细胞死亡的方式之一,同时也是多柔比星诱导慢性心脏损伤的病理表现之一[21]。实验结果显示,与NS 组相比,多柔比星药物浓度为3 mg/kg 时心脏组织中凋亡蛋白Cleaved-caspase3 的表达量未见明显增高,Bax/Bcl2 比值也无明显上升(P＞0.05)。而当药物浓度达到4 mg/kg 后,与NS 组相比,Bax/Bcl2 比值明显增加,有统计学差异,Cleaved-caspase3 的表达量增加,但无统计学意义(P＞0.05)。当给药浓度为5～6 mg/kg 时,Bax/Bcl2 比值与Cleaved-caspase3 表达均明显增加,见图2A～2F。

图2 不同浓度多柔比星对心肌细胞凋亡的影响(n=6)Note.A～D,Representative Western blot of Cleaved-caspase3、Bax、Bcl2 and GAPDH protein expression.E,A statistical chart of Cleaved-caspase3 relative expression levels.F,Statistical diagram of the ratio of Bax protein relative level expression to Bcl2 protein relative level expression.Compared with normal saline group,***P＜0.001,*P＜0.05,nsP＞0.05.Figure 2 Effects of different concentrations of doxorubicin on myocardial apoptosis

2.3 不同浓度多柔比星对小鼠心肌纤维化的影响

通过对心脏组织进行天狼猩红染色,结果显示:3 mg/kg 多柔比星组与NS 组相比,胶原纤维沉积较少,心肌纤维化程度不明显,无统计学差异(P＞0.05),见图3A、3B。当多柔比星剂量达到4 mg/kg以上时,与NS 组相比,心脏组织中可见明显的胶原纤维沉积,心肌纤维化程度加重,有统计学差异(P＜0.05),图3A、3B。横向比较不同浓度多柔比星给药组组间差异发现,小鼠心脏心肌纤维化程度并未随着多柔比星给药浓度的增加而上升,可能是小鼠心脏纤维化程度不具备明显的剂量依赖性特征,或者是给药后观察时长不够导致。

图3 不同浓度多柔比星对小鼠心肌纤维化的影响(n=6)Note.A,Mice cardiomyocytes Sirius scarlet dye.B,Statistical map of the proportion of cardiac fibrosis in mice.Compared with normal saline group,*P＜0.05,nsP＞0.05.Figure 3 Effects of different concentrations of doxorubicin on myocardial fibrosis in mice

2.4 不同浓度多柔比星对小鼠心肌细胞萎缩的影响

前期通过对小鼠的一般情况进行统计,发现多柔比星呈剂量依赖性降低小鼠的心脏重量,说明多柔比星可能导致心脏萎缩。通过对小鼠心脏组织进行WGA 染色发现,3 mg/kg 浓度造模组与NS 组相比,小鼠单个心肌细胞大小未见明显缩小,无统计学差异(P＞0.05)。而当多柔比星浓度达到4 mg/kg 以上时,小鼠单个心肌细胞可见明显缩小,差异具有统计学意义(P＜0.05),见图4。

图4 不同浓度多柔比星对小鼠心肌细胞萎缩的影响(n=6)Note.A,Mice cardiomyocytes wheat germ lectin staining.B,Statistical diagram of the effect of doxorubicin at different concentrations on the crosssectional area of myocardial cells in mice.Compared with normal saline group,*P＜0.05,nsP＞0.05.Figure 4 Effects of different concentrations of doxorubicin on myocardial cell atrophy in mice

3 讨论

多柔比星为临床上治疗实体肿瘤的经典药物,临床研究发现长期使用多柔比星会增加肿瘤病人患心血管疾病的风险,以心律失常、左室功能障碍、充血性心力衰竭等为主,其原因多数认为是多柔比星随剂量及时间累积对心肌细胞损伤导致的凋亡、萎缩以及对心肌纤维化的促进作用共同导致的心室重构[3],在基础病理生理学以及药理学研究中,小鼠腹腔注射多柔比星是常用的体内模型[5],可以很好地模拟临床患者化疗后诱发的心脏毒性。

多柔比星除了急性大剂量心脏损伤外,小剂量随时间和剂量蓄积是目前模型使用非常多的造模方式,但因为国内外文献中对多柔比星诱导心脏模型的给药浓度与给药时长不同,且未有统一定论[13,22],前期课题组研究发现多柔比星损伤剂量与致死量窗口非常窄,导致模型难以重复,本研究观察不同剂量多柔比星在一定时间(4 周)内蓄积后体重,心脏重量,生存率及病理学指标如凋亡、萎缩、纤维化等指标,寻找比较合适的造模剂量。从实验结果可以看出,随着多柔比星药物浓度增加,小鼠体重和心脏重量下降,生存率下降,但给药浓度低于4 mg/kg 则指标恶化不明显,高于6 mg/kg 后小鼠大量死亡,提示4～6 mg/kg 的给药浓度是较合适的造模方法。

多柔比星导致心室重构的主流观点是引起心脏萎缩[23-24],在本研究中,我们使用了不同剂量的多柔比星对小鼠心肌质量的影响进行评估。研究发现当多柔比星给药浓度达4 mg/kg,且体内药物累积剂量达40 mg/kg 时,小鼠的心脏指数显著下降,与目前的临床给药方案范围接近,且与临床实验中发现的当人体内多柔比星的累积剂量接近为30 mg/m2,会发生亚急性心肌萎缩的结论一致[25]。对心肌细胞横截面积统计,进一步发现当多柔比星药物浓度达4 mg/kg 是心肌细胞萎缩的开始,显微镜下可见心脏中段横截面积与心肌细胞横截面积明显缩小。既往有观点认为心肌细胞凋亡亦可能导致了心脏萎缩[26-27],本次课题组对心肌组织的凋亡标志蛋白Cleaved-caspase3、Bax、Bcl2 的观察佐证了此观点:3 mg/kg 浓度的多柔比星组凋亡蛋白Cleaved-caspase3 表达及Bax/Bcl2 比值相较NS 组未见明显上升,而当多柔比星浓度达到4 mg/kg 后,心脏中凋亡蛋白Cleaved-caspase3 的表达及Bax/Bcl2 的比值均明显上升。在4～6 mg/kg 给药浓度范围内可见凋亡蛋白Cleaved-caspase3 的表达及Bax/Bcl2 的比值呈剂量依赖性上升,课题组不同剂量多柔比星对乳鼠心肌细胞凋亡的体外研究(数据未发布)亦佐证了体内的趋势。

除了心肌细胞萎缩、凋亡外,心肌纤维化也是导致心室重构的另一中病理表现[28]。为了探讨不同浓度多柔比星对小鼠心脏纤维化程度的影响,课题组对不同剂量多柔比星处理后小鼠的心脏石蜡切片采用天狼猩红染色,结果显示3 mg/kg 多柔比星组小鼠相较NS 组心肌纤维化比例未见明显增加,当多柔比星浓度达到4 mg/kg 时,可见明显的胶原沉积在心脏间质中,心肌纤维化加重,4～6 mg/kg模型组小鼠心肌纤维化程度明显比3 mg/kg 模型组严重,但3 组模型组组间两两比较发现,小鼠心肌纤维化程度大约一致,并未随着多柔比星浓度与剂量的进一步增多而加重,可能是由于多柔比星剂量累积到一定程度后,小鼠心脏纤维化程度不具备明显的剂量依赖性特征,或者是给药后观察时长不够导致。

本研究尚存一些不足之处,未对小鼠心功能、血流动力学等指标进行检测,但是本研究通过心脏重量、心胫比、心重比、心脏组织HE 染色、WGA 染色、天狼猩红染色及凋亡蛋白检测等指标从侧面反映了多柔比星可诱导小鼠心室重构,相较心超更具说服力。本研究也未从药物时间依赖性角度对多柔比星诱导小鼠心脏损伤进行研究,有待后续更进一步深入探讨。

综上所述,当多柔比星给药浓度达到4 mg/kg时,小鼠心脏结构发生改变,可见心脏缩小,心肌细胞萎缩,心肌细胞凋亡及心肌纤维化等,当给药浓度达到7 mg/kg 时,小鼠多数死亡,反应出多柔比星造模小鼠心脏损伤窗口比较窄,4～6 mg/kg 可作为多柔比星诱导小鼠慢性心脏损伤模型的参考浓度。本实验从整体上对不同浓度给药剂量的多柔比星模型组的诱导的心脏损伤加以全面地评价、分析并提供安全、可靠的给药剂量。