首发精神分裂症肠道菌群特征及其与精神症状的关系☆

李鑫 赵雪 卓恺明 刘登堂 禹顺英

既往动物研究显示肠道菌群与学习记忆障碍、精神运动亢进等精神分裂症样行为有关[1]。临床研究显示，精神分裂症患者与健康对照比较，部分肠道菌群菌种比例和多样性存在差异[2-3]。还有研究指出菌种水平与精神分裂症的症状严重程度存在关联[4]。在精神分裂症的肠道菌群研究中，抗精神病药是干扰因素，因为有证据显示几乎所有抗精神病药物都具有一定的抗生素活性[5]。目前针对未使用抗精神病药的精神分裂症患者肠道菌群研究尚不深入。因此，为排除药物对患者肠道菌群的影响，本研究以首次发作且未使用抗精神病药的精神分裂症患者为研究对象，初步探索患者与对照间肠道菌群的差异，以及患者肠道菌群特征与精神症状之间的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象本研究为病例对照研究。2020年7月至2021年8月于上海市精神卫生中心招募首次发作且未使用抗精神病药的精神分裂症住院患者为患者组。纳入标准：①根据《精神疾病诊断与统计手册第五版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,5th Edition,DSM-5）诊断为精神分裂症；②首次发作，从未服用过抗精神病药物；③年龄18～50岁。排除标准：①患有自身免疫性疾病、胃肠疾病、糖尿病；②患有其他精神疾病；③孕妇、哺乳期妇女；④近1个月内曾使用抗生素；⑤近1个月有明显腹泻或便秘。

同期通过网络宣传在社区招募健康对照为对照组。入组标准：①无精神疾病；②从未服用过抗精神病药物；③年龄、性别和体质指数（body mass index，BMI）与患者匹配。排除标准与患者组一致。

共纳入42例首发未用药精神分裂症患者和47名健康对照。本研究经上海交通大学医学院附属精神卫生中心伦理委员会批准。所有被试签署知情同意书。

1.2 社会人口学特征和临床症状评估通过与入组者访谈，记录年龄、性别、民族、当前吸烟状况、BMI等资料。临床精神科医生对精神分裂症患者进行症状量表评定，包括精神病症状维度评定量表（clinician-rated dimensions of psychosis symptom severity,CRDPS）[6]和阳性与阴性症状量表（positive and negative syndrome scale,PANSS）[7]。

1.3 粪便样本收集和16S rRNA测序

1.3.1 粪便样本采集 用10 mL无菌密封集便盒取受试者新鲜粪便，在温度4℃条件下，4 h内送到实验室-20℃保存。

1.3.2 样品DNA提取 使用GHFDE100 DNA分离试剂盒（浙江杭州设备制备有限公司，20190952）提取粪便样本细菌总基因组DNA。提取的DNA使用NanoDropND-1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，USA）和琼脂糖凝胶电泳进行DNA浓度和完整性鉴定。

1.3.3 16S rRNA基因测序和分析 对细菌16S rRNA基因V4区域进行PCR扩增。PCR扩增产物用Agencourt AMPure XP珠纯化（Beckman Coulter,Indianapolis,IN），并用PicoGreen双链DNA分析试剂盒（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）进行定量。等量收集扩增子后在Illumina NovoSeq6000平台（Illumina,USA）进行对端测序。此工作在杭州谷禾信息技术有限公司平台完成。

1.4 生物信息学分析序列数据分析使用QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0，http://qiime.org/）和R包（v3.2.0）。用Illumina Novaseq测序平台进行双端测序并得到原始数据，配对拼接成单条序列。用QIIME软件对序列进行质控过滤，得到有效序列。α-多样性用QIIME软件计算，其中Chao1指数用于估计群落中操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）数目，Shannon指数侧重群落的丰富度以及稀有OTU，Simpson指数侧重均匀度。β-多样性分析利用OTU的丰度信息对unifrac距离构建weighted unifrac距离。

1.5 统计学方法人口学资料分析采用SPSS 23.0，年龄、BMI、受教育年限和量表分数用±s描述，组间比较用独立样本t检验。肠道菌群α-多样性Chao1和Shannon指数符合正态分布，组间比较采用独立样本t检验，Simpson指数不符合正态分布，用Wald-Wolfowitz检验；β-多样性通过多变量统计学方法主成分分析（principal component analysis，PCA）比较组间差异。肠道菌群丰度组间比较使用基于线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）的LEfSe分析，用LefSe软件，统计学差异的LDA值（logarithmic LDA score）设为2。精神分裂症患者肠道菌群与症状量表评分相关性分析使用Pearson相关检验。检验水准α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 社会人口学特征患者组和对照组年龄（P=0.50）、性别（P=0.19）、BMI（P=0.38）、受教育年限（P=0.51）和是否吸烟（P=0.30）没有统计学差异，见表1。

表1 首发未用药精神分裂症患者和健康对照的社会人口特征及临床症状评估

2.2 肠道微生物群落结构

2.2.1 α-多样性分析 患者组和对照组α-多样性的Chao1指数存在差异（t=2.36，P=0.01），对照组高于患者组，但Shannon（P=0.49）和Simpson（P=0.13）指数组间没有统计学差异，见表2。

表2 首发未用药精神分裂症患者与健康对照肠道菌群的α-多样性分析

2.2.2 β-多样性分析 PCA分析提取3个主成分，结果表明两组间菌群组成存在统计学差异（P＜0.05），患者组肠道菌群聚类比对照组更紧密。见图1。

2.2.3 肠道菌群物种组成丰度分析 LefSe分析显示，患者组和对照组之间21个特征菌属的丰度有差异（LDA值＞2）。患者组肠道菌群中有4个纲富集，分别为α-变形菌纲、芽孢杆菌纲和红蝽菌纲；2个目富集，分别为乳杆菌目和红蝽菌目；3个科富集，分别为链球菌科、放线菌科和紫单胞菌科；5个属富集，分别为放线菌属、链球菌属、厌氧菌属、瘤胃球菌属和副杆菌属。对照组肠道菌群中有1个目富集，为巴斯德氏菌目；1个科富集，为巴斯德氏菌科；4个属富集，分别是罗斯氏菌属、毛螺菌属、梭状芽胞杆菌属。见图2。

2.3 肠道菌群水平与临床症状相关性患者组毛螺菌属（r=-0.49，P＜0.01）和枸橼酸杆菌属（r=-0.36，P=0.02）水平与CRDPS得分呈负相关，而考拉杆菌属水平与CRDPS得分呈正相关（r=0.25，P=0.02）。链球菌属水平与PANSS阴性症状得分呈正相关（r=0.39，P＜0.01），且与PANSS阳性症状得分呈负相关（r=-0.31，P=0.04）。毛螺菌属水平与PANSS一般精神病理量表得分呈负相关（r=-0.33，P=0.03）。其他菌群水平与症状评分无统计学相关性（P＞0.05）。图3列出与临床症状相关的16个菌属。

3 讨论

本研究以首发未用药精神分裂症患者为研究对象分析精神分裂症与健康对照肠道菌群多样性和菌群构成特征的差异。发现在α-多样性上，虽然Shannon指数和Simpson指数在患者组和对照组间没有统计学差异，但患者组Chao1指数低于对照组，说明首发未用药精神分裂症患者肠道菌群OTU数减少，其多样性下降。在β-多样性上，患者组与对照组肠道菌群也存在显著差异。本研究有关α-多样性的结果与部分研究有所不同，如既往研究[3-4,8-10]发现患者组和对照组肠道菌群α-多样性的Shannon指数、Simpson指数和Chao1指数均没有统计学差异。但是，ZHENG等[2]的研究发现患者组和对照组在α-多样性中Chao1和Shannon指数有统计学差异。本研究有关β-多样性的结果也支持了LI等[8]的结论，即患者组与对照组之间β-多样性存在差异。结合抗精神病药有类抗菌作用的结论[5]，推测上述各项研究结果存在少许差异可能与是否使用抗精神病药有关。

本研究发现患者组肠道菌群富集放线菌科，与既往研究[9]结果一致。本研究发现患者组富集乳杆菌目，对照组富集毛螺菌属，这与SHEN等[3]的研究结果一致，但SHEN等[3]的研究发现对照组链球菌属富集，本研究结果与之不一致。考虑本研究和既往部分研究结果不一致，可能与研究对象是否用过抗精神病药物、样本量差异及地区生活习惯差异等因素有关，但仍需进一步研究。

本研究还发现患者组肠道菌群部分菌属水平与精神症状有关。SCHWARZ等[11]与本研究都发现毛螺菌属与症状严重程度呈负相关。LI等[8]的研究发现棒状杆菌属的丰度与阴性症状负相关，而本研究中棒状杆菌属与阴性症状相关无统计学意义。出现不同结果可能与个体差异、抗精神病药物使用有关。在其他精神疾病与肠道菌群的研究中，链球菌属已被证明在重度抑郁症患者中丰度较高[12]，神经性厌食症患者毛螺菌属丰度低于健康对照[13]，注意缺陷多动障碍患者中巨单胞菌属丰度高于健康对照[14]。本研究结果结合上述研究结果，推测链球菌属、毛螺菌属和巨单胞菌属在精神疾病中可能具有一定的作用。

本研究发现首发未用药精神分裂症患者肠道菌群特征与健康对照存在差异，部分菌群相对丰度与精神症状相关。本研究纳入的对象排除了抗精神病药的影响，研究结果初步揭示了首发未用药精神分裂症患者肠道菌群多样性与部分菌属比例等特征。此外，既往有关肠道菌群的研究中对精神症状的评估多数使用PANSS量表，而本研究除了使用PANSS量表外，还使用了CRDPS量表，增加了症状评估的维度。但本研究仍存在一定局限性，如样本量较小，这限制了探索肠道菌群差异及评估精神症状和肠道菌群关系的统计学效能。未来研究需进一步明确肠道菌群改变和精神分裂症发病的因果关系，为精神分裂症的早期干预、治疗提供新的理论依据。