葛根素对人皮肤鳞状细胞癌中PI3K/AKT信号通路激活状态的干预作用

段强 冯群燕

[摘要]目的：研究葛根素对人皮肤鳞状细胞癌（CSCC）中磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路激活状态的干预作用。方法：收集人CSCC组织（52例）及正常皮肤组织（35例），培养人CSCC细胞株SCL-1、A431、HSC-5和人永生化角质形成细胞株HaCaT细胞，检测p-PI3K、p-AKT的表达水平;SCL-1细胞进行分组，用不同剂量葛根素（20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L）处理，转染阴性对照（NC）质粒或PI3K质粒，检测细胞增殖活力、侵袭数目及p-PI3K、p-AKT的表达水平;BALB/c-nu裸鼠皮下注射SCL-1细胞建立移植瘤模型，100 mg/kg葛根素灌胃处理3周后检测移植瘤质量、体积及p-PI3K、p-AKT的表达水平。结果：人CSCC组织中p-PI3K、p-AKT的表达水平高于正常皮膚组织（P<0.05）;人CSCC细胞株中p-PI3K、p-AKT的表达水平高于HaCaT细胞且SCL-1中p-PI3K、p-AKT表达上调最显著（P<0.05）;不同剂量葛根素处理后，SCL-1细胞的增殖活力、侵袭数目及p-PI3K、p-AKT的表达水平均降低（均P<0.05）;转染质粒后，PI3K质粒+80μmol/L葛根素组SCL-1细胞的增殖活力、侵袭数目高于NC质粒+80μmol/L葛根素组（P<0.05）;葛根素组裸鼠的移植瘤质量、体积及p-PI3K、p-AKT的表达水平均低于对照组（P<0.05）。结论：PI3K/AKT信号通路过度激活与CSCC发病有关，葛根素通过抑制该通路发挥抗CSCC作用。

[关键词]皮肤鳞状细胞癌;葛根素;增殖;侵袭;PI3K/AKT信号通路

[中图分类号]R739.5    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2022）04-0105-04

Activation Status of PI3K/AKT Signaling Pathway in Human Cutaneous Squamous Cell Carcinoma and the Intervention Effect of Puerarin

DUAN Qiang，FENG Qunyan

（Department of Dermatology，Xianyang Central Hospital，Xianyang 712000，Shaanxi，China）

Abstract： Objective To study the intervention effect of puerarin on the activation status of phosphatidylinositol-3 kinase （PI3K） / protein kinase B （AKT） signaling pathway in human  cutaneous squamous cell carcinoma（CSCC）. Methods human CSCC tissues （52 cases）and normal skin tissues （35 cases） were collected， human CSCC cell lines SCL-1， A431， HSC-5 and human immortalized keratinocyte line HaCaT were cultured. Then the expression levels of p-PI3K and p-AKT were detected. SCL-1 cells were divided into groups， treated with different doses of Puerarin （20 μmol/L， 40 μmol/L， 80 μmol/L）， and transfected with negative control （NC） plasmid or PI3K plasmid. Then the proliferation viability， invaded numbers， the expression levels of p-PI3K and p-AKT were detected. The transplanted tumor model was established by subcutaneous injection of SCL-1 cells into BALB /c-nu nude mice， 100 mg/kg puerarin was given by gavage for 3 weeks and the weight and volume of transplanted tumor， the expression levels of p-PI3K and p-AKT were detected. Results The expression levels of p-PI3K and p-AKT in human CSCC tissue were higher than those in normal skin tissue （P<0.05）， the expression levels of p-PI3K and p-AKT in human CSCC cell line were higher than those in HaCaT cell line （P<0.05）， and the expression levels of p-PI3K and p-AKT in SCL-1 were up-regulated most significantly（P<0.05）. After different doses of puerarin treatment， the proliferation viability， invaded number and the expression levels of p-PI3K and p-AKT in SCL-1 cells decreased （all P<0.05）.After plasmid transfection， the proliferation viability， invaded number of PI3K plasmid+80 μmol/L puerarin group were higher than those in NC plasmid+80 μmol/L puerarin group（P<0.05）. The weight and volume of transplanted tumor and the expression levels of p-PI3K and p-AKT in puerarin group were lower than those in control group （P<0.05）. Conclusion The overactivation of PI3K/AKT signaling pathway relates to the pathogenesis of CSCC. Puerarin exerts its anti CSCC effect by inhibiting this pathway.

Key words： cutaneous squamous cell carcinoma; puerarin; proliferation; invasion; PI3K/AKT signaling pathway

人皮肤鳞状细胞癌（Cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC）是常见的皮肤恶性肿瘤之一，起源于表皮角质形成细胞，发病率呈逐年升高趋势。其恶性程度高、生长迅速，发病受到多种因素的影响，涉及复杂生物信号网络的异常激活[1-2]。磷脂酰肌醇-3激酶（Phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB，又稱AKT）通路是调控细胞增殖、侵袭等生物学行为的重要信号通路，该通路的异常激活与食管鳞状细胞癌、宫颈鳞状细胞癌的发生密切相关[3-4]。CSCC相关的细胞实验证实PI3K/AKT通路抑制剂LY294002对CSCC细胞的增殖和侵袭具有抑制作用[5]，提示PI3K/AKT通路是CSCC潜在的治疗靶点。

葛根是临床上应用广泛的中药材，其活性成分葛根素被证实具有抗肿瘤作用，国内李冰的研究证实葛根素对食管癌细胞的增殖和侵袭具有抑制作用，抑制PI3K/AKT通路是与之相关的分子机制[6]。目前，CSCC发病过程中PI3K/AKT通路的变化及葛根素的治疗价值均不清楚。因此，本研究将通过一系列细胞实验及动物实验来探究CSCC中PI3K/AKT信号通路的状态及葛根素对该通路的干预作用。

1  材料和方法

1.1 临床样本：人CSCC组织为2017年4月-2020年6月在笔者医院手术切除的标本，均经术后病理诊断为CSCC且术前未接受过放化疗;人正常皮肤组织为同期在笔者医院接受植皮手术的患者，均为全厚皮片。人CSCC组织共52例，其中男性患者34例、女性患者18例，年龄42～67岁、平均（58.69±10.28）岁;人正常皮肤组织共35例，其中男性18例、女性17例，年龄36～60岁、平均（52.03±11.31）岁。临床样本的收集及检测均取得笔者所在医院伦理委员会批准。

1.2 细胞株及动物：人CSCC株SCL-1、A431、HSC-5和人永生化角质形成细胞株HaCaT细胞（ATCC公司，美国）;BALB/c-nu裸鼠、雄性、8～10周龄、16只[菲诺克生物科技有限公司，上海，生产许可SCXK（沪）2018-0005]。

1.3 试剂与仪器：葛根素、结晶紫（Sigma公司）;阴性对照（Negative control，NC）质粒、PI3K质粒（生工生化公司，上海）;MTS细胞增殖检测试剂盒（Promega公司，美国）;PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT一抗（CST公司，美国）;显微镜（尼康公司，日本）;凝胶电泳系统及成像系统（Bio-rad公司，美国）;酶标仪（ABI公司，美国）。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养及分组：SCL-1、A431、HSC-5、HaCaT细胞在含有10%胎牛血清的培养基中进行贴壁培养，细胞铺满90%后用0.25%胰蛋白酶进行消化传代，接种在培养板内用于p-PI3K、p-AKT表达的检测。

另取消化传代的SCL-1细胞进行分组。为验证葛根素的调控作用，SCL-1细胞分为对照组及不同剂量葛根素组，对照组用不含药物的培养基处理，不同剂量葛根素组分别用含有20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L葛根素的培养基处理。为验证PI3K/AKT通路在葛根素发挥调控作用中的意义，SCL-1细胞分为转染NC质粒的NC质粒组、转染NC质粒并用80 μmol/L葛根素处理的NC质粒+80 μmol/L葛根素组、转染PI3K质粒并用80 μmol/L葛根素处理的PI3K质粒+80μmol/L葛根素组。

1.4.2 p-PI3K、p-AKT表达的检测：取CSCC组织及正常皮肤组织，加入RIPA裂解液提取组织中的蛋白;收集培养板内的细胞，加入RIPA裂解液提取细胞内的蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度，根据测定结果取20μg蛋白进行Western blot实验。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶内电泳分离不同分子量的蛋白，转膜至PVDF膜后封闭1 h、孵育一抗过夜，分别使用1：1 000稀释的p-PI3K及p-AKT一抗、1：2 000稀释的PI3K、AKT一抗、1：5 000稀释的β-actin一抗。次日，孵育二抗1 h，最后在凝胶系统内显影，得到p-PI3K、p-AKT、PI3K、AKT、β-actin的条带及吸光值，计算p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT作为p-PI3K、p-AKT的表达水平。

1.4.3 细胞增殖活力的检测：SCL-1细胞接种在96孔培养板内，按照1.4.1的方法分组干预24 h，采用MTS细胞增殖检测试剂盒进行增殖活力的检测，按照试剂盒说明书进行染色后在酶标仪上检测每个细胞孔490 nm波长的吸光值A490。

1.4.4 细胞侵袭的检测：收集分组干预后的SCL-1细胞，用无血清培养基重悬并接种在Transwell上层小室内，将含有10%胎牛血清的培养基放入Transwell下层小室内以趋化上层小室内的SCL-1细胞侵袭，12 h后取上层小室膜，4%多聚甲醛固定后用结晶紫染色，在显微镜下观察并对侵袭细胞进行计数。

1.4.5 成瘤能力的动物实验：取BALB/c-nu裸鼠，在右背部皮下注射SCL-1细胞密度为5×107个/毫升的细胞悬液100 μl。接种第15天时，移植瘤直径约4 mm，将移植瘤裸鼠随机分为对照组和葛根素组，对照组给予20 ml/kg生理盐水灌胃、1次/天，葛根素组给予含有100 mg/kg葛根素的生理盐水（体积20 ml/kg）灌胃、1次/天，连续3周后解剖移植瘤并称重、测量长宽，计算移植瘤体积=0.5×长×宽2。

1.5 统计学方法：采用SPSS 21.0软件录入数据，实验数据均为计量资料且经正态性检验符合正态分布，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 人CSCC组织与正常皮肤组织中p-PI3K、p-AKT表达的比较：人CSCC组织中p-PI3K、p-AKT的表达水平高于正常皮肤组织，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2.2 人CSCC细胞株和人永生化角质形成细胞株中p-PI3K、p-AKT表达的比较：SCL-1、A431、HSC-5细胞中p-PI3K、p-AKT的表达水平高于HaCaT细胞，差异有统计学意义（P<0.05），且SCL-1细胞中p-PI3K的表达水平高于A431、HSC-5细胞，差异有统计学意义（P<0.05），且p-AKT的表达水平高于HSC-5细胞，差异有统计学意义（P<0.05），与A431细胞比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。

2.3 不同剂量葛根素对SCL-1细胞中p-PI3K、p-AKT表达的影响：20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L葛根素处理后，SCL-1细胞中p-PI3K、p-AKT的表达水平均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3。

2.4 不同剂量葛根素对SCL-1细胞增殖、侵袭的影响：20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L葛根素处理后，SCL-1细胞的A490水平、侵袭数目均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图4。

2.5 过表达PI3K对80 μmol/L葛根素抑制SCL-1细胞中p-PI3K、p-AKT表达的影响：与NC质粒组比较，NC质粒+80μmol/L葛根素组SCL-1细胞中p-PI3K、p-AKT的表达水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）;与NC质粒+80 μmol/L葛根素组比较，PI3K质粒+80 μmol/L葛根素组SCL-1细胞中p-PI3K、p-AKT的表达水平增加，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.6 LY294002对葛根素抑制SCL-1细胞增殖、侵袭的影响：与NC质粒组比较，NC质粒+80 μmol/L葛根素组SCL-1细胞的A490水平、侵袭数目降低，差异有统计学意义（P<0.05）;与NC质粒+80 μmol/L葛根素组比较，PI3K质粒+80μmol/L葛根素组SCL-1细胞的A490水平、侵袭数目增加，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.7 葛根素对SCL-1细胞体内成瘤能力的影响：与对照组比较，葛根素组移植瘤小鼠的移植瘤体积及质量均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.8 葛根素对移植瘤中p-PI3K、p-AKT表达的影响：与对照组比较，葛根素组移植瘤小鼠的移植瘤中p-PI3K、p-AKT的表达水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。

3  讨论

多数CSCC可以通过手术切除获得根治、预后良好，但也有少部分CSCC患者会发生复发和转移[7-8]，因此需要寻找有效的辅助治疗手段以抑制CSCC细胞的增殖和侵袭。本研究将具有抗肿瘤作用的葛根素用于CSCC的治疗，以PI3K/AKT信号通路为切入点，通过细胞实验和动物实验探究了葛根素的抗CSCC作用。

PI3K/AKT信号通路是目前已知在多种恶性肿瘤发病及病理进展中起重要作用的通路。PI3K和AKT是该通路中主要的信号分子，以磷酸化的形式发生级联激活，进而启动下游cyclinD1、c-myc、β-catenin等原癌基因表达并促进癌细胞增殖及侵袭、促进肿瘤生长和转移[9-10]。在食管鳞癌[3]、宫颈鳞癌[4]、头颈部鳞癌[11]等鳞状细胞癌的病灶内，p-PI3K、p-AKT的表达均明显增加。本研究以正常皮肤组织为对照，检测到CSCC组织中p-PI3K、p-AKT的表达明显增加;以人永生化角质形成细胞株HaCaT为对照，检测到三种CSCC细胞株中p-PI3K、p-AKT的表达明显增加，表明PI3K/AKT通路的异常激活与CSCC的发病有关。

在三种CSCC细胞株中，SCL-1细胞中p-PI3K、p-AKT表达增加最显著，因此本研究继续在该细胞株中观察了葛根素的抗CSCC作用。鳞状细胞癌相关的研究证实，葛根素对食管鳞癌细胞[6]、宫颈鳞癌细胞[12]的增殖、侵襲及细胞中PI3K/AKT通路的激活具有抑制作用。本研究将不同剂量的葛根素用于CSCC细胞株SCL-1的干预，结果显示葛根素显著抑制SCL-1细胞中p-PI3K、p-AKT的表达，同时也使细胞的增殖活力及侵袭数目降低，表明葛根素具有抗CSCC作用且这一作用可能与抑制PI3K/AKT通路激活有关，与既往文献在其他类型鳞癌中观察到的葛根素抗肿瘤作用及相关机制吻合。

PI3K/AKT通路的激活在恶性肿瘤的发生发展中起到促增殖、促侵袭作用。已有国内外相关的研究证实，该通路的抑制剂LY294002显著抑制多种鳞状细胞癌细胞的增殖及侵袭[5，13-15]。本研究已经证实葛根素抑制CSCC细胞增殖、侵袭及PI3K/AKT通路的激活，进一步通过转染质粒、过表达PI3K的方式验证PI3K/AKT通路在葛根素抑制CSCC细胞增殖、侵袭中的作用，过表达PI3K后p-PI3K、p-AKT的表达均增加，同时葛根素抑制SCL-1细胞增殖及侵袭的作用明显减弱，表明葛根素至少部分通过抑制PI3K/AKT通路抑制SCL-1细胞的增殖及侵袭。最后，本研究还通过移植瘤小鼠验证了葛根素抗CSCC的作用，皮下注射建立CSCC移植瘤模型后给予葛根素灌胃干预，结果发现移植瘤体积、质量及p-PI3K、p-AKT的表达均降低，表明葛根素能够抑制CSCC移植瘤的生长及PI3K/AKT通路的激活。

目前葛根素的临床应用主要集中在心血管疾病领域，葛根素注射液用于冠心病、心力衰竭的治疗能够改善血液流变学、抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统[16-17]，但葛根素注射液在恶性肿瘤患者中的应用尚缺乏临床证据。尽管如此，本研究的上述细胞实验及动物实验证实葛根素具有抗CSCC作用，在细胞水平葛根素显著抑制CSCC细胞的增殖和侵袭，在动物水平葛根素显著抑制CSCC移植瘤的生长;同时，葛根素显著抑制CSCC细胞及移植瘤中PI3K/AKT通路的激活，这是葛根素发挥抗CSCC作用的分子机制之一。未来，葛根素有望成为治疗CSCC的备选药物，但仍需更多的研究来将其推广至临床应用。

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[收稿日期]2021-03-03

本文引用格式：段强，冯群燕.葛根素对人皮肤鳞状细胞癌中PI3K/AKT信号通路激活状态的干预作用[J].中国美容医学，2022，31（4）：105-109.