miR-216a-5p靶向RAB1A基因调控食管癌细胞增殖、迁移及侵袭的分子机制

杜容宇 靳永欣 马银龙 常浩 赵一帆

(河南科技大学附属许昌市中心医院胸心外科，河南 许昌 461000)

食管癌是常见的消化系统肿瘤，早期多无症状，患者确诊时多为中晚期，因此化疗、放疗和靶向治疗是其主要治疗方法，其侵袭性导致患者预后较差，生存率低〔1,2〕。miR-216a-5p在肺癌组织及细胞系中表达明显降低，上调miR-216a-5p可抑制肺癌细胞侵袭〔3〕及恶性进展〔4〕。miR-216a-5p还可通过靶向调控己糖激酶(HK)2表达抑制葡萄膜黑色素瘤的生长〔5〕，在前列腺癌中lncRNA HOTTIP靶向抑制miR-216a-5p促进癌细胞增殖和迁移〔6〕。Ras相关蛋白Rab-1A(RAB1A)基因在舌癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、结直肠癌、胃癌及子宫颈癌等多种恶性肿瘤中均出现高表达，与肿瘤的发生发展有关〔7〕。本研究探讨miR-216a-5p对食管癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响及分子机制。

1 材料与方法

1.1材料 美国ATCC公司提供人食管癌细胞株Eca109、EC9706和KYSE450及正常食管上皮细胞Het-1A；美国Gibco公司提供DMEM高糖培养基和RPMI1640培养基；美国Sigma-Aldrich公司提供牛血清白蛋白(BSA)、胰蛋白酶；日本同仁化工提供CCK8试剂盒；美国Corning公司提供Transwell板；英国Abcam公司提供RAB1A抗体、细胞周期蛋白(Cyclin)D1抗体、p21抗体、基质金属蛋白酶(MMP)-2抗体、MMP-9抗体、人表皮生长因子受体(EGFR)抗体、蛋白激酶B(AKT)抗体、mTOR抗体、p-EGFR抗体、p-AKT抗体、p-mTOR抗体和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体；上海吉玛制药有限公司提供引物、miR-216a-5p模拟物(miR-216a-5p)、抑制剂(anti-miR-216a-5p)、RAB1A的过表达载体(pcDNA-RAB1A)、空载体和阴性对照(miR-NC和anti-miR-NC)及双荧光载体的构建；美国Promega公司提供双荧光素酶报告系统；美国Invitrogen公司提供Lipofectamine 2000转染试剂、总RNA提取试剂盒、 实时荧光定量-聚合酶链反应(PCR)试剂盒、反转录试剂盒；美国Abcam公司提供抗RAB1A抗体和GAPDH抗体；美国Bio-Rad公司提供显微镜、发光仪、酶标仪及实时荧光定量PCR仪；上海碧云天生物技术有限公司提供二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将食管癌细胞Eca109和KYSE450培养于含10 %胎牛血清(FBS)、1%青-链霉素的RPMI1640培养基中，食管癌细胞EC9706和人正常食管上皮细胞Het-1A培养于含10%FBS、1%青-链霉素的DMEM高糖培养基中。

1.2.2细胞转染 将对数生长期的Eca109细胞稀释为1×106个细胞/ml，接种于6孔板中，根据转染试剂盒说明书进行转染，miR-216a-5p过表达组：miR-NC组和miR-216a-5p组；miR-216a-5p抑制剂组：anti-miR-NC组和anti-miR-216a-5p组；miR-216a-5p和RAB1A双过表达组：miR-216a-5p+pcDNA组和miR-216a-5p+pcDNA-RAB1A组；RAB1A野生型(WT-RAB1A)和突变型(MUT-RAB1A)双荧光载体，将等体积脂质体和各组载体片段轻柔混匀，室温孵育20 min，然后转染Eca109细胞中，设置不转染的空白对照，置于37℃ 5%CO2培养箱培养6 h，换成RPMI1640完全培养基，转染48 h，收集细胞，进行后续实验。

1.2.3实时荧光定量-PCR检测RNA的表达 按照总RNA提取试剂盒说明书提取正常食管上皮细胞和各组食管癌细胞总RNA，以RNA为模板按照反转录试剂盒说明书合成cDNA，以cDNA为模板按照实时荧光定量PCR的说明书进行反应合成miR-216a-5p和RAB1A mRNA，运用2-ΔΔCt方法进行数据分析。

1.2.4CCK-8法检测细胞增殖 Eca109细胞转染48 h后以4×103个/孔接种于96微孔板中，分别在培养至24、48和72 h，弃上清后每孔避光加入10 μl CCK-8试剂，继续培养3 h，酶标仪测定OD450 nm吸光度(A)值。

1.2.5Transwell实验检测细胞迁移和侵袭 迁移实验：上室中接种各组Eca109细胞后将500 μl含10%FBS的RPMI1640培养基加入下室，甲醛固定迁移的细胞，结晶紫染色，显微镜观察计数，随机选取视野5个，取均值。侵袭实验：基质胶稀释后加入上室后接种各组Eca109细胞，后续实验步骤同迁移实验。

1.2.6双荧光素酶报告实验 WT-RAB1A和MUT-RAB1A载体分别与miR-NC或miR-216a-5p共转染培养好的Eca109细胞，转染48 h，收集细胞后检测荧光素酶活性。

1.2.7Western印迹 提取Het-1A细胞和各组食管癌细胞蛋白并检测浓度。将蛋白样本进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室温封闭2 h，加入稀释的一抗，RAB1A抗体(1∶1 000)、CyclinD1抗体(1∶2 500)、p21抗体(1∶2 000)、MMP-2抗体(1∶200)、MMP-9抗体(1∶3 000)、EGFR抗体(1∶2 000)、AKT抗体(1∶1 500)、mTOR抗体(1∶1 000)、p-EGFR抗体(1∶2 000)、p-AKT抗体(1∶2 000)、p-mTOR抗体(1∶1 500)和抗GAPDH抗体(1∶2 000)，4℃孵育过夜。洗膜3次，然后加入稀释的酶标二抗，室温孵育1 h。以GAPDH为内参，分析蛋白水平。

1.3统计学方法 采用 SPSS21.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1食管癌细胞系中miR-216a-5p与RAB1A的表达量 与正常食管上皮细胞Het-1A相比，在食管癌细胞Eca109、EC9706和KYSE450组中RAB1A 的mRNA和蛋白表达量显著升高(P<0.05)，miR-216a-5p表达量显著降低(P<0.05)，见表1和图1。

2.2miR-216a-5p过表达可抑制食管癌Eca109细胞增殖、迁移和侵袭 与miR-NC组相比，miR-216a-5p组Eca109细胞中p21表达水平显著升高(P<0.05)，细胞活力和CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平均显著降低(P<0.05)，迁移和侵袭细胞数显著减少(P<0.05)。见图2，表2。

表1 miR-216a-5p和RAB1A在食管癌细胞和 正常食管上皮细胞中的表达

1～4：Het-1A组,Eca109组,EC9706组,KYSE450组图1 RAB1A在食管癌细胞和正常肝细胞中的表达

1～3：空白对照组，miR-NC组，miR-216a-5p组图2 Western印迹检测细胞增殖、 迁移及侵袭相关蛋白表达

表2 miR-216a-5p过表达对食管鳞癌Eca109细胞增殖、迁移及侵袭的影响

2.3miR-216a-5p靶向调控RAB1A的表达 Targetscan预测结果显示，RAB1A的3′UTR序列中含有与miR-216a-5p互补的核苷酸序列，见图3。与miR-NC组相比，过表达miR-216a-5p可使WT-RAB1A的荧光素酶相对活性显著降低(P<0.05)，见表3。anti-miR-216a-5p组RAB1A蛋白水平(0.98±0.13)显著高于anti-miR-NC组(0.63±0.11，P<0.05)；miR-216a-5p组RAB1A蛋白水平(0.30±0.05)显著低于miR-NC组(0.60±0.10，P<0.05)。见图4。

图3 RAB1A的3′UTR中含有与 miR-216a-5p互补的核苷酸序列

表3 双荧光素酶报告实验

1～4：anti-miR-NC组，anti-miR-216a-5p组，miR-NC组，miR-216a-5p组图4 miR-216a-5p靶向调控RAB1A蛋白表达

2.4RAB1A过表达联合miR-216a-5p过表达对细胞增殖、迁移及侵袭的影响 miR-216a-5p+pcDNA-RAB1A组细胞活性、迁移及侵袭细胞数、CyclinD1及MMP-9水平均显著高于miR-216a-5p+pcDNA组(P<0.05)。见表4、图5。

表4 RAB1A过表达逆转miR-216a-5p过表达对食管鳞癌Eca109细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用

1,2:miR-216a-5p+pcDNA组，miR-216a-5p+pcDNA-RAB1A组图5 Western印迹检测各组细胞增殖、 迁移及侵袭相关蛋白表达

2.5RAB1A过表达逆转miR-216a-5p过表达对Eca109细胞EGFR/AKT/mTOR信号通路的抑制作用 与miR-NC组相比，miR-216a-5p组的EGFR、AKT和mTOR蛋白表达量无明显变化(P>0.05)，p-EGFR、p-AKT和p-mTOR表达均显著降低(均P<0.05)；与miR-216a-5p+pcDNA组相比，miR-216a-5p+pcDNA-RAB1A组EGFR、AKT和mTOR蛋白表达量无显著变化(P>0.05)，p-EGFR、p-AKT和p-mTOR表达均显著升高(均P<0.05)。见表5、图6。提示过表达miR-216a-5p可抑制Eca109细胞EGFR/AKT/mTOR通路，过表达RAB1A逆转了过表达miR-216a-5p对EGFR/AKT/mTOR通路的抑制作用。

表5 RAB1A过表达逆转miR-216a-5p过表达对Eca109细胞EGFR/AKT/mTOR信号通路的抑制作用

1～4:miR-NC组，miR-216a-5p组，miR-216a-5p+pcDNA组，miR-216a-5p+pcDNA-RAB1A组图6 Western印迹检测Eca109细胞中 EGFR/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达

3 讨 论

中国太行山地区是食管癌的高发地区，接触致癌物质和营养缺乏可能是食道癌的主要危险因素〔8〕，虽然治疗方法有极大改进和提高，但食管癌确诊时多已发展至晚期，患者的治疗效果很差。

研究表明，miRNA在食管癌中的异常表达可能影响癌细胞的凋亡、增殖、侵袭和转移等生物过程，并与食管癌的诊断、预后及多药耐药性有关〔9,10〕。研究表明，miR-216a-5p被认为是一种癌基因，与多种癌症，如肾细胞癌、结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌等进展和转移有关〔11〕。miR-216a-5p在肝癌和乳腺癌中均是lncRNA DANCR的靶点，DANCR可靶向miR-216a-5p抑制癌细胞的增殖和侵袭〔12,13〕。 本研究结果说明miR-216a-5p在食管癌发展中具有重要作用。此外，本研究结果提示RAB1A可能是miR-216a-5p的靶基因。RAB1A是小GTPase的Rab家族成员，在调节从内质网到高尔基体和高尔基隔间内的小泡运输中有很好的功能，RAB1A通过特定的下游效应器途径控制整合素β1的循环和定位到脂质筏，从而调节细胞迁移〔14〕。在卵巢癌中，RAB1A是miR-655-3p的靶基因，可抑制癌细胞的增殖和迁移〔15〕。RAB1A在胃癌和结直肠癌中均过表达，其高表达与肿瘤的浸润和分期有关，且均与mTOR的靶向耐药相关〔16,17〕。本研究结果证实了RAB1A在miR-216a-5p对食管癌的调控中发挥作用。有研究表明，RAB1A是mTOR的激活剂〔16,17〕，因此本研究假设miR-216a-5p靶向RAB1A通过EGFR/AKT/mTOR通路在食管癌中发挥抑癌作用，结果表明过表达miR-216a-5p可抑制Eca109细胞的EGFR/AKT/mTOR通路，过表达RAB1A逆转了miR-216a-5p过表达对EGFR/AKT/mTOR通路的抑制作用，进一步验证了miR-216a-5p与RAB1A的靶向调控关系。

综上，在食管癌Eca109细胞中过表达miR-216a-5p可靶向抑制RAB1A的表达，可能通过抑制EGFR/AKT/mTOR通路进而抑制Eca109细胞增殖、迁移和侵袭。