LINC00342靶向miR-384对肾癌细胞生物学行为的影响

刘华 冯玉 杨静 张瑞城

(1海口市第四人民医院肾内科，海南 海口 571100；2海南医学院第一附属医院肾内科)

肾癌是临床常见的一种泌尿系统恶性肿瘤，临床主要采用手术治疗肾癌，但患者预后较差〔1，2〕。目前肾癌发病机制尚未阐明，因而寻找影响肾癌细胞增殖、迁移及侵袭等生物学行为的基因有助于提高肾癌治疗效果及改善患者预后。研究表明一些长链非编码RNA(LncRNA)可调控肾癌细胞增殖及侵袭等生物学行为〔3，4〕。LncRNA LINC00342在非小细胞肺癌中表达上调，并可促进肿瘤细胞生长及转移〔5〕。但LINC00342在肾癌发生及发展过程中的作用机制尚未可知。研究表明LncRNA对微小RNA(miRNA)具有海绵吸附作用，LncRNA通过竞争性结合miRNA并抑制miRNA表达参与肿瘤发展过程〔6〕。生物信息学分析显示LINC00342与miR-384可能存在靶向调控关系，研究表明miR-384可抑制肾癌细胞生长及侵袭〔7〕。但LINC00342是否通过调控miR-384表影响肾癌进展尚未可知。本研究主要探讨LINC00342在肾癌中的表达及其对肾癌细胞恶性生物行为的影响，并探究其对miR-384的作用。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 肾癌786-O细胞购自上海匹拓生物科技有限公司；杜氏改良培养基(DMEM)购自美国Thermo Fisher Scientific公司；0.25%胰蛋白酶购自广州市达晖生物技术有限公司；LINC00342小干扰RNA(si-LINC00342)、乱序无意义阴性序列(si-NC)、miR-384模拟物(mimics)及阴性对照(miR-NC)、miR-384特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-384)及其阴性对照(anti-miR-NC)均购自上海吉玛制药技术有限公司；pcDNA3.1购自上海北诺生物科技有限公司；Trizol、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)、细胞凋亡检测试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；Transwell小室、基质胶购自上海宇进生物科技有限公司；放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液购自北京全式金生物技术有限公司；兔抗人B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体购自合肥康源生物科技研究所；兔抗人P21抗体购自美国CST公司；兔抗人基质金属蛋白酶(MMP)-2、上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)抗体购自武汉菲恩生物科技有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗购自北京博尔西科技有限公司。

肾癌组织与癌旁组织标本来源：收集2017年6月至2018年3月海口市第四人民医院收治的33例肾癌患者，男20例，女13例，平均年龄(56.57±9.48)岁，所有患者经病理证实为肾癌，术前均未接受化疗或放疗。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者知情且签署同意书。

1.2方法

1.2.1细胞转染及实验分组 采用DMEM培养基常规培养肾癌786-O细胞，待细胞融合度达到70%时进行传代培养。将si-NC、si-LINC0034转染至786-O细胞，记为si-NC组、si-LINC00342组；将si-LINC0034分别与anti-miR-NC、anti-miR-384共转染至786-O细胞，记为si-LINC00342+anti-miR-NC组、si-LINC00342+anti-miR-384组。

1.2.2实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测LINC00342、miR-384的表达水平 提取肾癌组织、癌旁组织及各组786-O细胞总RNA，取2 μg RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR反应，LINC00342以GAPDH为内参，miR-384以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算LINC00342、miR-384相对表达量。

1.2.3MTT比色法检测细胞增殖抑制率 收集各组786-O细胞，按试剂盒说明操作，酶标仪检测490 nm处相对吸光度值(OD)，计算细胞增殖抑制率〔(空白组-实验组)/空白组×100%〕。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组786-O细胞，按试剂盒说明操作，置于FACS Calibur流式细胞仪及应用Cellauest软件检测各组细胞凋亡。

1.2.5Transwell实验检测细胞迁移和侵袭 迁移：收集各组对786-O细胞，取200 μl细胞悬液加入Transwell小室上室，下室加600 μl含血清培养液，培养24 h，依次采用多聚甲醛固定(20 min)与0.1%结晶紫染液染色(10 min)，擦拭未迁移细胞，显微镜(200倍)下观察计数。侵袭：稀释基质胶，取40 μl稀释液加入Transwell小室上室，然后按迁移操作进行。

1.2.6双荧光素酶报告基因检测LINC00342与miR-384的靶向关系 StarBase预测显示miR-384可能是LINC00342的靶基因，构建野生型和突变型报告基因载体WT-LINC00342和MUT-LINC00342，将其分别与miR-NC、miR-384共转染至786-O细胞，培养48 h后检测各组相对荧光素酶活性。为探讨LINC00342对miR-384表达水平的影响，将786-O细胞随机分成4组：pcDNA3.1组、pcDNA3.1-LINC00342组、si-NC组、si-LINC00342组，通过qRT-PCR检测miR-384表达水平。

1.2.7Western印迹检测Bcl-2、P21、Bax、MMP-2、E-cadherin蛋白表达 提取各组细胞总蛋白，沸水煮10 min变性；进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，80 V 30 min，120 V 90 min)；电泳结束后转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h，4℃条件下孵育蛋白一抗稀释液，24 h后加入二抗稀释液，室温孵育1 h，曝光，显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1LINC00342在肾癌组织和癌旁组织中的表达 肾癌组织中LINC00342的表达水平(2.14±0.23)显著高于癌旁组织(1.01±0.13,P<0.05)。

2.2抑制LINC00342对786-O细胞增殖、凋亡的影响 si-LINC00342组786-O细胞中LINC00342的表达水平显著低于si-NC组(P<0.001)，提示成功降低786-O细胞中LINC00342的表达。与si-NC组相比，si-LINC00342组786-O细胞增殖抑制率和凋亡率显著升高，P21、Bax蛋白表达量显著升高，Bcl-2蛋白表达量显著降低(均P<0.001)，见表1、图1、图2。

表1 抑制LINC00342对786-O细胞增殖、凋亡的影响

图1 抑制LINC00342对786-O细胞凋亡的影响

图2 抑制LINC00342对细胞786-O增殖、凋亡 蛋白表达的影响

2.3抑制LINC00342对786-O细胞迁移、侵袭的影响 相较于si-NC组，si-LINC00342组迁移与侵袭细胞数均显著减少，MMP-2蛋白表达量显著降低，E-cadherin蛋白表达量显著升高(均P<0.001)，见表2、图3、图4。

表2 抑制LINC00342对细胞786-O迁移、侵袭的 影响

图3 786-O细胞迁移、侵袭(结晶紫，×200)

图4 Western印迹检测迁移、侵袭相关蛋白的表达

2.4LINC00342靶向、调控miR-384 StarBase预测显示LINC00342与miR-384有互补的核苷酸序列，见图5。WT-LINC00342与miR-384共转染的786-O细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.001)，见表3。pcDNA3.1-LINC00342组miR-384表达水平(0.26±0.03)显著低于pcDNA3.1组(0.99±0.09，P<0.05)；与si-LINC00342组miR-384表达水平(2.04±0.21)显著高于si-NC组(0.98±0.08，P<0.05)。

图5 LINC00342靶向miR-384

表3 双荧光素酶报告实验

2.5抑制miR-384能逆转抑制LINC00342对786-O细胞增殖、凋亡的影响 si-LINC00342+anti-miR-384组786-O细胞中miR-384的表达水平显著低于si-LINC00342+anti-miR-NC组(P<0.001)。提示成功降低786-O细胞中miR-384的表达。与si-LINC00342+anti-miR-NC组相比，si-LINC00342+anti-miR-384组786-O细胞增殖抑制率和凋亡率显著降低，Bcl-2蛋白表达量显著升高，P21、Bax蛋白表达量降低(均P<0.001)，见图6、图7、表4。

图6 抑制miR-384能逆转抑制LINC00342对786-O 细胞增殖、凋亡的影响

1，2:si-LINC00342+anti-miR-NC组、si-LINC00342+anti-miR-384组，图9同图7 抑制miR-384能逆转抑制LINC00342对786-O 细胞增殖、凋亡蛋白表达的影响

表4 抑制miR-384能逆转抑制LINC00342对786-O细胞增殖、凋亡的影响

2.6抑制miR-384能逆转抑制LINC00342对786-O细胞迁移、侵袭的影响 与si-LINC00342+anti-miR-NC组比较，si-LINC00342+anti-miR-384组迁移与侵袭细胞数显著增多，MMP-2蛋白表达量显著升高，E-cadherin蛋白表达量显著降低(均P<0.001)，见表5、图8、图9。

表5 抑制miR-384能逆转抑制LINC00342对细胞786-O 迁移、侵袭的影响

图8 抑制miR-384能逆转抑制LINC00342对786-O 细胞迁移、侵袭的影响(结晶紫，×200)

图9 抑制miR-384能逆转抑制LINC00342对786-O 细胞迁移、侵袭蛋白表达的影响

3 讨 论

LncRNA在肾癌转移过程中发挥重要调控作用，下调或上调LncRNA可影响肾癌细胞增殖、迁移及侵袭等生物学行为〔8～10〕。LINC00342高表达量可促进婴儿血管瘤的生长〔11〕。研究表明LINC00342在非小细胞肺癌中呈高表达并可作为患者预后不良的重要标志物〔12，13〕。本研究结果提示LINC00342表达量升高可能促进肾癌的发生。本研究结果提示抑制LINC00342可抑制肾癌细胞增殖，促进细胞凋亡。研究表明P21蛋白表达水平升高可抑制肾癌细胞生长，诱导细胞周期阻滞〔14〕。Bcl-2属于抗凋亡蛋白，Bax属于抗凋亡蛋白，研究表明肾癌细胞中Bcl-2表达水平降低，Bax表达水平升高并可促进细胞凋亡〔15〕。本研究结果提示抑制LINC00342表达可能通过调控相关蛋白表达从而抑制肾癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。研究表明MMP-2可通过降解细胞外基质而促进肿瘤细胞扩散及转移，同时上皮-间质转化(EMT)可促进肿瘤浸润及转移，EMT上皮型标志物E-cadherin表达下调可增强迁移及侵袭能力〔16〕。本研究结果提示抑制LINC00342表达可抑制肾癌细胞迁移及侵袭。

LncRNA TSIX可通过充当miR-384的海绵分子从而促进胰腺癌增殖〔17〕。研究表明miR-384可分别通过靶向负调控Smad核内相关蛋白(SNIP)1、多效生长因子(PTN)的表达从而抑制肿瘤细胞进展〔18，19〕。相关报道指出miR-384通过靶向AKT3抑制大肠癌细胞增殖〔20〕。本研究证实LINC00342可靶向结合并负向调控miR-384的表达，抑制miR-384表达联合抑制LINC00342表达可明显降低肾癌细胞增殖抑制率及细胞凋亡率，减弱细胞迁移及侵袭能力。提示抑制LINC00342表达可能通过上调miR-384表达而减弱肾癌细胞的恶性生物学行为。