碳[13C]-尿素中基因毒性杂质的来源分析与去除方法

魏翠雯，陈 凯，陈坚明，张旭杰

（深圳市中核海得威生物科技有限公司，广东深圳 518000）

碳[13C]-尿素的制剂用于呼气试验诊断幽门螺杆菌感染，幽门螺杆菌是一种可以在胃中生长的细菌，可导致胃炎、消化性溃疡，并与胃癌密切相关。碳[13C]-尿素生产工艺的一大难点是基因毒性杂质的控制，分析碳[13C]-尿素生产过程中基因毒性杂质的来源和有效去除，对提升药品质量具有重要意义。

碳[13C]-尿素生产过程中产生的基因毒性杂质包括氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯，氨基甲酸甲酯（MC）、氨基甲酸乙酯（EC）分别被国际癌症研究机构（IARC）归类为3类和2A类致癌物[1]。1943年Nettleship等[2]发现了氨基甲酸乙酯致癌以来，人们对于其致癌机理和致癌作用不断地研究和探讨[3]，发现氨基甲酸乙酯在啮齿类动物，如大鼠、小鼠、仓鼠、猴子等体内均具有致癌性。在人体内，氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯的代谢与啮齿类动物中的代谢途径是类似的，是一种潜在的致癌物。在生物体内，氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯能迅速、几乎完全被肠道、皮肤吸收，会导致体内多位点致癌。

1 碳[13C]-尿素的生产工艺

基于Franz R.A.和Applegath F.的基本原理（有机化学（1961），第26卷，第2604-2605页），设计生产工艺如图1所示：

图1 设计生产工艺图

2 碳[13C]-尿素中基因毒性杂质产生的机理分析

Ough[4]在1976年的研究中，发现尿素与乙醇在室温条件下反应72h会产生氨基甲酸乙酯，氨基甲酸乙酯的形成不仅与尿素、乙醇的浓度有关，还与贮藏温度有较大关系，也有研究报道，氨基甲酸乙酯的形成速度与温度呈线性关系[5]。

碳[13C]-尿素生产过程中，在加热条件下脱出一分子的氨气转化为中间体A，中间体A化学性质不稳定，在反应体系中可能发生以下副反应，如图2所示：

图2 碳[13C]-尿素中氨基甲酸酯的形成机理

（1）在合成反应和干燥除硫阶段，与甲醇发生加成反应会生成氨基甲酸甲酯。

（2）在重结晶阶段，与乙醇发生加成反应会生成氨基甲酸乙酯。

对碳[13C]-尿素各个工艺环节的氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯进行研究，结果表明，氨基甲酸甲酯产生于合成反应步骤，在干燥和重结晶步骤中去除；氨基甲酸乙酯产生于重结晶步骤，养晶结束后通过减压抽滤进入碳[13C]-尿素母液。说明干燥工艺对氨基甲酸甲酯有很好的去除效果，重结晶工艺对于氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯有很好的去除效果，去除的氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯被富集于母液中，须进一步研究干燥工艺和母液蒸干工艺。

3 碳[13C]-尿素生产中基因毒性杂质的去除方法

3.1 减少基因毒性杂质的产生

3.1.1 优化合成反应时间

氨基甲酸甲酯主要产生于合成反应过程，尿素在加热条件下，脱去一分子氨后，与甲醇发生加成反应，生成副产物氨基甲酸甲酯。按合成反应方程式CO、NH3投料比例应为1∶2，但因13CO价格昂贵，按同位素尿素合成一般采用非同位素原料过量投料，确定13CO、NH3投料比例为1∶5，可获得较高收率。根据实验研究结果，尿素合成的较佳温度为120℃，反应釜内的压力经8～24h后，合成反应基本完成，综合考虑提高13CO的反应率和控制杂质的产生，规定压力稳定1h后，结束合成反应。继续延长反应时间，13CO的反应率提升程度很有限，同时还会增加氨基甲酸甲酯、缩二脲等合成副产物的产生。

3.1.2 重结晶采用梯度升温设计

氨基甲酸乙酯主要产生于重结晶阶段，碳[13C]-尿素在加热条件下，脱去一分子氨后，与乙醇发生加成反应，生成副产物氨基甲酸乙酯。在与重结晶工艺相同条件下，使用1.1kg普通尿素进行模拟，分别采用直线升温和梯度升温两种方案进行对比。结果表明，采用直线升温工艺，重结晶阶段产生氨基甲酸乙酯为0.09%；采用梯度升温工艺，分别在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃保持20min，重结晶阶段产生氨基甲酸乙酯为0.04%。说明采用梯度升温设计，可有效减少氨基甲酸乙酯的产生。

因此，重结晶工艺采用梯度升温的设计，可有效减少氨基甲酸乙酯的生成。

3.2 去除基因毒性杂质

3.2.1 优化干燥2工艺

使用1.1kg普通尿素添加0.5%氨基甲酸甲酯的方式进行模拟，考察干燥时间对氨基甲酸甲酯的影响，结果见图3。结果表明，氨基甲酸甲酯随着干燥时间的延长迅速下降，干燥时间6h后，到达平台期，为了充分保证去除效果，干燥2时间应控制在不少于8h。

图3 干燥2过程中氨基甲酸甲酯的变化图

3.2.2 优化母液干燥工艺

在母液干燥过程的不同时间点取样检测，氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯的含量随母液干燥时间的变化情况见图4。结果表明，延长母液干燥时间，可显著降低母液中氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯的含量，在干燥至6h后，降低至平台期，因此，应控制母液干燥时间不少于6h。

图4 母液干燥过程中氨基甲酸酯的变化图

3.2.3 控制母液干燥品的加入比例

母液干燥品中碳[13C]-尿素的含量占90%以上，以1kg/批为例，产生的母液干燥品约250g，即每个批次约有25%的活性成分进入了母液，有必要对母液进行回收。但为了避免基因毒性杂质随着母液套用次数的增加而产生富集，应严格控制母液干燥品中的基因毒性杂质含量，当母液干燥品中基因毒性杂质含量明显高于终产品限度时，应按照工艺去除能力折算，严格控制母液干燥品的套用比例。

4 结论

氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯作为碳[13C]-尿素中一种潜在致癌的副产物，严重影响产品的质量和用药安全性，对患者的健康存在不利影响。研究如何在碳[13C]-尿素生产过程中严格控制氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯的含量有着重要意义。

1）碳[13C]-尿素生产过程中，氨基甲酸甲酯产生于合成反应步骤，反应压力稳1h后，结束合成反应，可有效减少氨基甲酸甲酯的产生；氨基甲酸乙酯产生于重结晶步骤，采用梯度升温的方式溶解，可有效减少氨基甲酸乙酯的产生。

2）延长干燥2步骤的时间，对去除氨基甲酸甲酯有明显效果，控制干燥2时间不少于6h，可有效控制碳[13C]-尿素成品中的氨基甲酸甲酯含量。

3）为避免母液干燥工艺产生氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯的富集，应控制母液干燥品中的氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯不得过0.1%。母液干燥时间不少于6h。