不同产地菊三七根中6个吡咯里西啶生物碱成分的比较

刘 艳， 鲜 新， 汪泓江， 李密密， 任冰如， 吕 寒， 陈 剑， 李维林

〔江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园) 江苏省抗糖尿病药物筛选技术服务中心， 江苏 南京 210014〕

菊三七〔Gynurajaponica(Thunb.) Juel.〕又名土三七，为多年生草本植物[1]，全草可入药，具有散瘀止血、解毒消肿的功效[2]。菊三七的根与传统药用植物三七〔Panaxnotoginseng(Burk.) F. H. Chen ex C. Chow et W. G. Huang〕的干燥根十分相似，患者误服后多会出现中毒现象[3]。

吡咯里西啶生物碱(pyrrolizidine alkaloids，PAs)成分在菊三七属(GynuraCass.)植物中广泛分布，可引起多种肝损伤[4]。为了探明不同产地菊三七中PAs的成分差异，本研究采用超高效液相-四级杆-飞行时间串联质谱技术(UPLC-Q-TOF/MS)对湖北、四川和云南不同产地野生菊三七中6个代表性PAs成分进行检测，比较了菊三七根中不同PAs成分在产地间的差异，以期为菊三七的安全使用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试野生菊三七的根于2018年8月至9月分别采自湖北恩施(东经109°32′23.96″、北纬30°09′57.56″)，四川乐山(东经103°26′24.86″、北纬29°34′53.62″)及云南的文山(东经104°14′10.93″、北纬24°10′38.50″)、武定(东经102°22′13.04″、北纬25°33′49.43″)和昆明(东经102°49′35.26″、北纬24°53′39.70″)，由江苏省中国科学院植物研究所任冰如研究员鉴定。每个产地挖取6～10个菊三七根，洗去根表面浮土，切片；于40 ℃烘干至恒质量后粉碎，过100目筛；置于-4 ℃冰箱中保存、备用。

主要仪器：Agilent 1260/6530 UPLC-Q-TOF/MS超高效液相-四级杆-飞行时间串联质谱仪(美国Agilent公司)；Direct-Q®UV超纯水机(美国Millipore公司)；SCX固相萃取柱(美国Phenomenex公司)；FG-24固相萃取仪(天津市富城达科技有限公司)。

主要试剂：千里光菲灵碱(批号Q-058-190329)和千里光宁(批号Q-064-190328)标准品购于南京春秋生物工程有限公司，全缘千里光碱(批号88040538)、倒千里光碱(批号88040511)、千里光宁N-氧化物(批号88432657)和千里光菲灵N-氧化物(批号88432665)标准品购于德国PhytoLab公司，所有标准品的纯度均大于98%；甲醇和乙腈购于美国Tedia公司，氨水购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，3个试剂均为色谱纯。

1.2 方法

1.2.1 分析条件 色谱分析条件：Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm， 1.7 μm，美国Waters公司)。以乙腈为流动相A、体积分数0.1%甲酸为流动相B进行梯度洗脱，洗脱程序如下：0～4 min，体积分数10%A；4～7 min，体积分数10%～15%A；7～9 min，体积分数15%～30%A；9～15 min，体积分数30%～90%A。柱温40 ℃，流速0.3 mL·min-1，进样量5 μL，检测波长210 nm，后运行时间5 min。

质谱分析条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；质量扫描范围m/z100～1 000；雾化器压力345 kPa；干燥气(N2)流速10 mL·min-1，温度350 ℃；毛细管电压4 000 V；碎裂电压175 V。用Agilent MassHunter B.05.00工作站处理相关实验数据。

1.2.2 标准曲线绘制 精确称取倒千里光碱标准品1.05 mg、千里光菲灵碱标准品1.02 mg、千里光菲灵N-氧化物标准品1.60 mg、全缘千里光碱标准品1.67 mg、千里光宁标准品2.14 mg、千里光宁N-氧化物标准品0.97 mg，分别用甲醇溶解并定容至5 mL，作为标准品母液；用甲醇将每个标准品母液依次稀释10、50、100、250、500和1 000倍；取等体积相同稀释倍数的6个标准品溶液，混匀后制成混合标准品溶液。按照上述色谱和质谱分析条件进样分析。以峰面积为纵坐标(y)、标准品质量浓度为横坐标(x)绘制标准曲线。倒千里光碱回归方程为y=2 256x+579 737(r2=0.999 0)，线性范围30～30 000 ng·mL-1；千里光菲灵碱回归方程为y=3 060x-349 124(r2=0.999 9)，线性范围29～29 143 ng·mL-1；千里光菲灵N-氧化物回归方程y=2 722x+1 361 790(r2=0.999 0)，线性范围46～45 714 ng·mL-1；全缘千里光碱回归方程为y=9 007x-168 200(r2=0.999 8)，线性范围48～47 714 ng·mL-1；千里光宁回归方程为y=6 484x-17 034(r2=0.999 1)，线性范围61～61 142 ng·mL-1；千里光宁N-氧化物回归方程为y=1 546x+1 176 912(r2=0.995 9)，线性范围22～22 571 ng·mL-1。

1.2.3 样品溶液制备及检测分析 取不同产地菊三七根粉末样品约1.0 g，精确称量后加入体积分数90%乙醇溶液30.0 mL，40 kHz超声提取1 h；过滤，滤液于50 ℃减压浓缩至无醇；浓缩液用0.05 mol·L-1稀硫酸溶液5.0 mL溶解后，在4 ℃条件下8 000 r·min-1离心5 min；将上清液加入SCX固相萃取柱中，分别用12 mL甲醇和12 mL蒸馏水冲洗，弃洗脱液；用10 mLV(氨水)∶V(甲醇)=3∶7的混合溶液洗脱SCX固相萃取柱，收集洗脱液，蒸干后用甲醇溶解并定容至25 mL，所得溶液即样品溶液。每个产地重复取样3次，分别按照上述方法制备样品溶液。所有样品溶液均按照上述色谱和质谱分析条件进样分析。

1.2.4 方法学考察

1.2.4.1 精密度考察 将混合标准品溶液连续进样6次，结果显示6个标准品峰面积的RSD值为3.51%～7.61%，表明精密度良好。

1.2.4.2 稳定性考察 取湖北恩施样品溶液，分别在样品溶液制备后0、2、4、8、12和24 h进样，记录不同时间的色谱峰面积。结果显示各峰面积的RSD值为4.86%～9.50%，表明样品溶液在24 h内稳定。

1.2.4.3 重复性考察 取湖北恩施菊三七根粉末6份，每份约1.0 g，精确称量后按照上述方法制备样品溶液，并按照上述色谱和质谱分析条件进样分析。结果显示各样品溶液峰面积的RSD值分别为5.63%～10.12%，表明该方法重复性良好。

1.2.4.4 加样回收率考察 取湖北恩施菊三七根粉末3份，每份约0.5 g，精确称量后分别精密加入0.5 g样品中含有的待测标准品量，按照上述方法制备样品溶液，并按照上述色谱和质谱分析条件进样分析，计算各成分的加样回收率及峰面积的RSD值。结果显示各标准品的加样回收率为98.15%～100.20%，峰面积的RSD值为4.27%～7.54%，表明该方法加样回收率较高。

1.3 数据处理

采用EXCEL 2016和GraphPad Prism 7软件对数据进行处理和单因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 结果和分析

不同产地菊三七根中吡咯里西啶生物碱(PAs)成分含量的比较结果见表1。由表1可见：不同产地菊三七根中PAs的成分组成及含量均存在一定差异。千里光菲灵N-氧化物和千里光宁N-氧化物在5个产地菊三七根中均存在，倒千里光碱仅存在于湖北恩施产菊三七根中；而千里光菲灵碱在云南文山产菊三七根中未检出，千里光宁在四川乐山产菊三七根中未检出，全缘千里光碱在云南文山和云南武定产菊三七根中未检出。云南昆明产菊三七根中千里光菲灵N-氧化物含量最高(2 098.45 μg·g-1)，全缘千里光碱含量最低(7.20 μg·g-1)。除云南昆明外，其余4个产地菊三七根中千里光宁N-氧化物含量最高；湖北恩施、四川乐山和云南武定产菊三七根中千里光菲灵N-氧化物含量最低，而云南文山产菊三七根中千里光宁含量最低。

各产地菊三七根中PAs总含量由高到低依次为云南昆明、云南文山、湖北恩施、云南武定、四川乐山。供试6个产地菊三七根中PAs总含量的最高值约为最低值的10倍，且在不同产地间存在显著(P<0.05)差异。

表1 不同产地菊三七根中吡咯里西啶生物碱(PAs)成分含量的比较

3 讨 论

吡咯里西啶生物碱(PAs)是一类在自然界中广泛分布的天然次生代谢产物，具有肝毒性[5]，其主要毒性靶器官是肝脏，还可引起肺、肾等器官损伤[6]。供试各产地菊三七根中均含有大量的PAs，总含量达310.47～3 107.12 μg·g-1，且PAs含量在不同产地间差异显著。刘贺之等[7]认为，PAs既是菊三七的有效止血成分，又是菊三七的毒性成分，如何控制菊三七的用药剂量是临床应用研究的重点。

研究表明：生长环境对植物次生代谢产物累积有较大影响[8]。本研究中，不同省份及同一省份不同地区菊三七根中的PAs种类和含量均存在较大差异，该结果可能与各产地的生境差异或样本数量较少(四川和湖北均只有1个样品)有关。在后期研究中应增加不同产地的样本数量，以探明生境对菊三七根中PAs形成的作用规律。另外，菊三七为多年生根用药材，很多多年生根用药材的有效成分含量会随生长年限发生明显变化[9，10]，而本研究使用的菊三七根来自野生植株，样株的生长年限可能存在较大差异，因此，关于生长年限对菊三七根中PAs累积的影响也需深入研究。