基于网络药理学和分子对接探析淫羊藿-牛膝药对治疗股骨头坏死的作用机制*

石 威，张俊忠，解鹏超，侯 燕，余 昕，李 磊，姜红江，，△

1 安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230000；2 山东中医药大学；3 滨州市中医医院；4 山东省文登整骨医院

股骨头坏死（osteonecrosis of femoral head，ONFH）是由于不同因素破坏了股骨头的血液供给，导致股骨头发生局部或完全性缺血，使股骨头微观结构如骨细胞、骨髓造血细胞及脂肪细胞坏死，最终导致股骨头塌陷的病理过程，是骨科最常见的临床疑难疾病［1］。常见的类型有激素性ONFH、酒精性ONFH 和外伤性ONFH。根据流行病学调查显示，该病多见于30～50 岁的中青年人群，我国ONFH 患者已有近800 万人，且近年来本病的发病率呈逐年升高的趋势，每年新增约15～20 万病例［2-3］。该病具有极高的致残率，已经严重危害了患者的生命健康并降低了患者的生活质量［4］。

中医学将ONFH 归属为“骨蚀”“骨痿”的范畴，认为ONFH 与肝肾亏虚、经脉瘀阻密切相关，总体治疗原则以补益肝肾、强筋健骨、活血化瘀为主［5］。中药治疗ONFH 有疗效确切、安全性高的优势，对ONFH 的防治具有很好的效果，在ONFH 的保髋治疗中起到了至关重要的作用［6］。淫羊藿是小檗科淫羊藿属植物，主要功效为补肾壮阳、祛风除湿、强筋健骨。药理学研究［7-8］表明，淫羊藿具有抗炎、舒张血管、免疫抑制、抗氧化以等作用。牛膝属于苋科牛膝属植物，主要功效为活血通经、补肝肾强筋骨、引火下行。药理学研究证明，牛膝具有促进血管内皮细胞生长、促进成骨细胞分化、预防凝血等作用［9-11］。结合中医基础理论和临床应用，淫羊藿、牛膝相须配对使用符合临床防治ONFH 的理念，但对其作用机制尚不明确，因此有必要进一步研究。

网络药理学是药理学融合医学、系统生物学、计算机科学等多学科而形成的一门新学科，能够全面地反应药物对疾病网络的分子作用机制［12］。本研究基于网络药理学和分子对接的方法，从淫羊藿、牛膝的化学物质基础出发，深入挖掘淫羊藿-牛膝药对调治ONFH 的关键靶点和潜在的分子作用机制并进行分子对接验证，以期更好的为治疗ONFH 的临床用药提供一定的理论参考，同时为新药的研发提供新思路。

1 资料与方法

1.1 淫羊藿-牛膝药对相关靶点筛选通过TCMSP 数据库［13］检索中药淫羊藿、牛膝化学成分，根据药物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且类药性指数（drug-likeness，DL）≥0.18［14］两个ADME属性值对活性成分进行初步筛选以获取活性化合物后查找药物作用的有效蛋白质靶点。

1.2 淫羊藿-牛膝药对“活性成分——靶点”网络筛选完蛋白质靶点后，利用Uniprot 蛋白质数据库（http：//www.uniprot.org）为化合物作用的蛋白质靶点信息进行标准化，使用Cytoscape 3.8.0［15］构建淫羊藿-牛膝“活性成分——靶点”网络并探究两者的关系。

1.3 ONFH 相关靶点检索通过检索OMIM 数据库［16］（http：//www.omim.org）、GeneCards数据库［17］（http：//genecards.org）中ONFH 的潜在靶点，结合DRUGBANK数据库（https：//go.drugbank.com/）挖掘治疗ONFH的临床药物作用靶点［18］。合并3个疾病数据库靶点后，删除重复值得到ONFH的靶点。

1.4 PPI网络构建和关键靶点筛选为明确淫羊藿-牛膝药对潜在靶点与ONFH相关靶点之间的相互作用，运用Venny 2.1.0平台（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）将淫羊藿-牛膝药对成分靶点与疾病靶点取交集并绘制韦恩图。运用Cytoscape 3.8.0中的BisoGenet，将淫羊藿-牛膝药对潜在靶点和ONFH的靶点分别导入BisoGenet，各生成1 个PPI 网络，再使用Cytoscape 中Merge取两者交集网络，最后利用CytoNCA［19］分析交集网络并进行网络拓扑进一步筛选出关键靶点。

1.5 淫羊藿-牛膝药对成分——ONFH 靶点功能与通路的富集分析Metascape 平台（https：//metascape.org）每月整合多个权威数据库，更新基因注释，具备富集分析、构建PPI 网络的强大功能［20-21］。将淫羊藿-牛膝调治股骨头坏死的共同靶点录入Metascape 平台，获取其主要的生物学过程和信号通路并进行富集分析，将获得的四个数据库资料根据P 值选用TOP20 数据采用微生信平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）绘制GO富集分析条形图、KEGG通路富集分析气泡图。

1.6 分子对接验证选择“活性成分——靶点”网络中的核心成分与PPI网络中治疗ONFH相关的关键靶点蛋白运用PUB 数据库、PDB 数据库，结合Autodock Tools 软件、Autodock-vina1.1.2 软件进行分子对接，预测靶点蛋白与小分子之间发生的交互作用，进而评价淫羊藿-牛膝药对活性成分与关键靶点之间的对接效果。

2 结果

2.1 淫羊藿、牛膝活性成分与靶点的获取初步提取淫羊藿化学成分130种、牛膝化学成分176种，经ADME筛选后共获得淫羊藿有效活性成分23种、牛膝有效活性成分16种，包括槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、广玉兰内酯（magnograndiolide）、汉黄芩素（wogonin）等。淫羊藿有效成分作用靶点459 个，牛膝有效成分作用靶点403个，合并后删除重复值共得到靶点231 个。利用Cytoscape 3.8.0 对淫羊藿、牛膝药对活性成分及其作用靶点的关系网络进行绘制和分析，共获得270 个节点与901 条关系，节点的面积代表Degree 值大小，面积越大说明该节点越重要。见表1、图1。

表1 淫羊藿-牛膝主要活性成分

图1 淫羊藿-牛膝药对活性成分靶点网络图

2.2 ONFH 相关靶点的获取从GeneCards 数据库中共获得ONFH 潜在靶点2033 个，Relevance Score 值越高代表该靶点与疾病联系更密切。此次研究设定Relevance Score 大于中位数的目标靶点作为ONFH的潜在靶点，在该数据库中ONFH靶点Relevance Score最大值为99.71，最小值为0.18，中位数为4.74，故设定Relevance Score＞4.74的靶点为ONFH的潜在靶点共1017个。结合OMIM、DrugBank 数据库补充相关靶点，合并3 个数据库相关靶点后删除重复值，最终得到2131个ONFH相关靶点。

2.3 PPI 网络的构建将筛选出来的药物有效活性成分靶点与ONFH 疾病靶点取交集，并通过Venny 平台制作韦恩图，得到淫羊藿-牛膝药对药物成分——ONFH 共同靶点138 个，见图2。运用Cytoscape 3.8.0 分别构建淫羊藿-牛膝药对和ONFH 的PPI 网络，从结果看：淫羊藿-牛膝药对潜在靶点可能与7865 个靶点产生作用，交互关系有175281 种；与ONFH 相关的靶点共有13263 个，交互关系可达246136 种，取两者交集网络，如图3。运用网络拓扑后，进行2次筛选出关键靶点80个，筛选策略见图4。

图2 淫羊藿-牛膝药对药物成分ONFH靶点韦恩图

图4 淫羊藿-牛膝药对关键节点筛选策略图

2.4 靶点功能与通路的富集分析应用Metascape数据平台对上述获取的80 个淫羊藿-牛膝药对调治ONFH 关键节点进行信号通路分析，借助微生信平台对结果进行可视化。由结果可见，多个靶点的功能与ONFH 的发生密切相关。淫羊藿-牛膝药对主要参与的生物学过程包括对无机物的应答（response to inorganic substance）、对脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）、对受伤的应答（response to wounding）、细胞对有机环化合物的应答（cellular response to organic cyclic compound）、对毒性物质的反应（response to toxic substance），见图5中BP；在细胞组分中，主要作用于细胞膜筏（membrane raft）、膜微区（membrane microdomain）、膜区（membrane region）等，见图5中CC；相关靶点调节ONFH的功能主要富集于转录因子结合（transcription factor binding）、蛋白质结构域特异性结合（protein domain specific binding）、核受体活性（nuclear receptor activity）、转录因子活性，直接配体调节序列特异性DNA 结合（transcription factor activity，direct ligand regulated sequencespecific DNA binding）、蛋白激酶结合（protein kinase binding）、细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）等，见图5 中MF。将KEGG 通路结果绘制成气泡图，气泡颜色从青到红代表Log10（P）值由小到大，气泡面积代表该通路的基因计数，横轴代表该通路基因所占有的比值，如图6 所示，KEGG 富集通路显示淫羊藿-牛膝药对防治ONFH 的 通 路 与PI3K-Akt 信 号 通 路、MAPK 信 号 通路、HIF-1 信号通路、TNF 信号通路、癌症通路以及破骨细胞的分化等相关。

图5 淫羊藿-牛膝药对治疗ONFH作用靶点富集分析条形图

图6 淫羊藿-牛膝药对治疗ONFH KEGG通路富集分析气泡图

2.5 分子对接结果选取活性成分——靶点网络图中前2个有效成分与关键靶点TP53进行分子对接验证，分子对接结果显示关键活性成分quercetin、kaempferol 与治疗ONFH 的关键作用靶点TP53 具有较好的结合活性，说明该研究的预测较为可靠。见图7。

图7 药物关键成分与核心靶点TP53分子对接结果

3 讨论

通过分析表1和图1可以得出淫羊藿-牛膝药对治疗ONFH 的核心有效成分可能为槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、汉黄芩素（wogonin）等。槲皮素是一种类黄酮化合物，存在于诸多植物类中药材中，淫羊藿和牛膝成分中都含有槲皮素，药理学研究表明，槲皮素具有抗炎、预防氧化等作用［22］，可通过MAPK 信号通路恢复成骨细胞功能，进而起到骨保护的功能［23-24］。山柰酚是黄酮醇类化合物，也同时包含在淫羊藿、牛膝之中，现代药理学证明山柰酚具有防治癌症、抗炎抗氧化等功效。汉黄芩素是从黄芩中提取出来的化合物，研究证明汉黄芩素具有抗炎抗氧化、保护血管等作用［25-26］。ONFH临床疼痛症状多由于炎症的局部反应所致，而活性物质槲皮素、山柰酚、汉黄芩素在炎症反应中均具有独特的生物特性，与治疗ONFH的理念不谋而合。

本研究经筛选后共得到80 个关键节点。根据Degree 值排名，其中较为重要的靶点有TP53、PPARG、PTGS2 等。有研究表明，产生ONFH 重要因素之一是脂质代谢紊乱，PPARG 正是体内脂肪形成的必要的转录因子，密切参与体内脂肪的代谢过程［27-28］。TP53 是一种抑癌基因，密切参与细胞凋亡，研究证实TP53 的高表达与ONFH 有关，其作用机制为上调凋亡因子Bax的表达［29-30］。

由KEGG 通路富集分析结果显示，淫羊藿-牛膝药对治疗ONFH 主要涉及以下几个信号通路：PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路、HIF-1 信号通路、癌症通路。1）PI3K-AKT 信号通路：李云隆等［31］认为PI3K通过激活激酶系统促使AKT逐渐被磷酸化，磷酸化后的AKT激活下游靶蛋白mTOR，从而激活该通路可以抑制自噬，进而改善ONFH 的进程。同时该通路已被证实与血管修复再生、成骨细胞分化、破骨细胞分化密切相关［32］。2）MAPK 信号通路：骨代谢失衡是导致ONFH 发生的重要机制，MAPK 是调节骨代谢平衡的重要信号传导系统，密切参与成骨细胞的增殖分化［33］，同时也是槲皮素干预ONFH 的重要因素［34］。由此可见淫羊藿-牛膝药对可通过MAPK 信号通路调节骨代谢从而发挥治疗作用。3）HIF-1 信号通路：研究证明，缺血缺氧同样也是导致ONFH 发生的重要机制［35］，HIF-1 信号通路是一种经典的缺氧代谢通路［36］，该信号通路在缺氧时密切参与了血管生成、骨吸收和新骨生成的骨修复过程［37］。

综上所述，淫羊藿-牛膝药对调治ONFH 的主要成分可能是槲皮素、山柰酚、汉黄芩素等，涉及到的通路有PI3K-Akt、MAPK、HIF-1、癌症通路等，与自噬、缺氧应激、炎症反应、血管生成、骨代谢等多个生物学过程息息相关，由此可知，淫羊藿-牛膝相须配伍使用并不是简单的相同成分含量的增加，而是通过信号通路互补，这为治疗ONFH 的临床用药提供一定的理论参考，同时为新药的研发提供新思路。