柔肝化纤颗粒对肝纤维化模型大鼠肝组织超氧化物歧化酶和丙二醛的影响*

段桂姣，王振常，吴珊珊

1 广西玉林第一人民医院，广西 玉林 537000；2 广西国际壮医医院

肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段，由于多种致病因素长期慢性刺激肝脏组织，使肝窦内肝星状细胞活化，导致胶原等细胞外基质（extracellular matrix，ECM）代谢失衡而沉积和肝组织重构所致［1］。在进展的适当阶段干预可逆转或阻断肝纤维化，从而延缓向肝硬化及肝癌进展［2］。肝纤维化是临床常见病，是肝癌发生的重要阶段［3-4］。研究发现，肝星状细胞的活化分为启动阶段和持续阶段，肝细胞受损凋亡后激活Kuffer细胞，促使其分泌过氧化物酶、超氧化物歧化 酶（superoxide dismutase，SOD）和 丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）等因子，这些因子开启肝星状细胞活化［5］。活化后的HSC 继续分泌细胞因子使其进入持续阶段。持续阶段由自分泌和旁分泌共同调节，打破ECM 合成与降解的平衡，造成ECM 的过度沉积和肝纤维化的形成。可见肝纤维化的发展是一个由多种细胞因子、多种蛋白传导通路参与的全身性病理过程。目前，肝纤维化动物模型的建立方法很多，其中四氯化碳（CCl4）模型是国内外最广泛应用的肝纤维化和肝损伤模型，这种建立动物模型的方法具有成模效率高、可重复性好、死亡率低、操作简单等优点，是一种简单实用的动物模型方法［6-7］。

柔肝化纤颗粒是在全国名老中医林沛湘（壮肝逐瘀煎）及关幼波教授治疗肝炎肝硬化有效验方基础上组方而成的，以“补肾柔肝、活血化瘀”为主，兼顾“健脾、解毒、化痰软坚”，临床应用显示出良好的保肝、防治肝纤维化、肝硬化作用［8-9］。研究证实，柔肝化纤颗粒可以抗脂质过氧化、调节机体各种免疫应答、保护肝细胞、促进肝内胶原蛋白降解［10］。本研究在前期研究基础上，通过分析柔肝化纤颗粒对CCl4所致肝纤维模型大鼠血液生化指标和肝脏内SOD和MDA含量的影响，探讨柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠模型的保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF 级SD 大鼠50 只，雄雌各半，体质量150～180 g，2月龄。大鼠购自广西医科大学实验动物研究所，实验动物许可证号：SYXK（桂）2003—0001。饲养条件：饲养于广西中医药大学第一附属医院医学分子生物学实验室，分笼饲养并保持实验室温度和相对湿度分别为20～24℃和40%～45%，保持通风光照良好。饲料为标准固体混合无菌饲料，饮水为高压灭菌蒸馏水，饲养期间每天日照12 h。本研究所涉及的动物相关操作均在广西中医药大学动物伦理委员会的批准下进行。

1.2 药物及试剂柔肝化纤颗粒（广西中医学药大学第一附属医院药剂科提供），药物组成：生黄芪45 g，生牡蛎30 g，黄精20 g，枸杞子20 g，薏苡仁45 g，橘红12 g，泽兰30 g，鳖甲30 g，鸡内金15 g，虎杖20 g，黑枣15 g。CCl4（广东汕头达濠精细化学品公司，批号：20090513）；秋水仙碱（西双版纳药业有限公司，批号：090205）；丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT），天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）（四川迈克生物科技股份有限公司，批号：20100318）。透明质酸（hyaluronic acid，HA）、层黏连蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原（P3NP）、Ⅳ型胶原（CⅣ）放射免疫分析药盒（北京北方生物技术研究所，批号：100320）；胶原Ⅰ第一抗体（Ab-2）（美国Santa Cruz公司，批号：20090315）；胶原Ⅲ第一抗体（武汉博士德生物工程有限公司，批号：20090505）。

1.3 实验仪器7180 型全自动生化分析仪（日本日立公司）；BeckmanSJ-21 型冷冻离心机（北京光明医疗仪器厂）；SN-697 型全自动双探头放射免疫γ计数器（上海核所日环光电仪器有限公司）；Cx3112L02 型生物显微镜（日本Olympus 公司）；AG135型精密电子天平仪（瑞士Nikon公司）；Z-7803型全自动组织包埋机（上海跃进医疗器械厂）。

1.4 实验方法

1.4.1 造模及处理 造模方法根据文献［7］报道及预实验确定。取健康SD大鼠50只，随机分为空白组（12 只）和模型组（38 只）。空白组皮下注射生理盐水，余大鼠皮下注射40 g/L CCl4橄榄油溶液造模，用量0.3 mL/100 g，首剂加倍，每周2 次，连续4 周，4 周后造模结束。随机抽取模型组2 只大鼠进行肝组织病理学检查，验证大鼠肝纤维化模型造模成功，将造模成功的大鼠按随机数字表法分为模型组、秋水仙碱组和柔肝化纤颗粒组，每组12 只。实验期间给予各组动物标准饲料，在同样条件下饲养，灌胃给药每日1 次，连续灌胃给药4 周，空白组和模型组给予等剂量的生理盐水，柔肝化纤颗粒组按4 g/kg比例给予柔肝化纤颗粒水溶液灌胃，秋水仙碱组按0.25 mg/kg 秋水仙碱水溶液灌胃。

1.4.2 标本采集 末次给药后，不禁水禁食，以10%水合氯醛0.3 g/kg 腹腔注射麻醉，经股动脉脉采血，制备血清，用于相关指标检测。取血后，每只大鼠剖取肝脏，在同一肝叶位置切取小块肝组织置入10%甲醛缓冲液固定，苏木素-伊红（HE）染色行病理组织学检查。

1.5 观察指标

1.5.1 一般情况 观察各组大鼠皮毛光泽度、精神状态、饮食、活动度及体质量改善程度。

1.5.2 肝功能指标 分别采用TBA-40FR 全自动生化检测仪检测大鼠ALT、AST 水平，测定严格按照使用说明书操作。

1.5.3 肝纤维化指标 在SN-697 全自动双探头放射免疫γ计数器上，采用放射免疫法测定各组血清中HA、LN、P3NP、CⅣ的含量。

1.5.4 肝脏指数、MDA及SOD测定 取肝组织，称取肝脏质量，每克组织加9 mL生理盐水，置匀浆机上10 000 r/min×10 s×3 次，制 备10% 匀浆，4000 r/min 离心10 min，取上清液置液氮中保存。运用比色法分别测定肾组织SOD、MDA的含量。

1.5.5 肝组织病理学 将制备好的大鼠肝组织切片置于60°C 烤箱内烤片约30 min，取出后常规脱蜡至水，苏木素染色5 min，清水冲洗后以1%盐酸酒精分化，随后以1%伊红染液浸染3 min，染色完成后以梯度酒精脱水，二甲苯透明、中性树胶封片并于显微镜下观察、拍照。观察各组大鼠肝纤维沉积情况。

1.6 统计学方法运用统计学软件SPSS 21.0进行数据统计分析，计量资料以±s表示，多组均数比较采用方差分析，组间差异的显著性采用配对样本t检验，计数资料采用秩和检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 造模完成后，空白组大鼠一般状态良好；造模组大鼠第一周出现易激怒，精神明显萎靡，皮毛光泽度欠佳，食欲不振，体质量减轻。实验期间模型组死亡2 只，考虑是灌胃刺破食道血管所致；秋水仙碱组死亡1 只，考虑是过度饮食致脑出血或灌胃刺破食道血管所致；柔肝化纤颗粒组死亡1只，考虑是灌胃刺破食道血管死亡。

2.2 大鼠肝脏指数与空白组比较，模型组肝脏指数明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，柔肝化纤颗粒组肝脏指数上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.3 大鼠血清ALT、AST 水平与空白组比较，模型组大鼠血清ALT、AST 含量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，柔肝化纤颗粒组大鼠血清ALT、AST 含量均降低（P＜0.05），差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠肝脏指数，血清ALT、AST水平比较（±s）

表1 各组大鼠肝脏指数，血清ALT、AST水平比较（±s）

注：*表示与空白组比较，P＜0.05；▲表示与模型组比较，P＜0.05；-表示无数值

组别空白组模型组秋水仙碱组柔肝化纤组鼠数12 10 11 11给药剂量--0.25 mg/kg 4 g/kg肝脏指数（%）4.5±1.3*3.2±0.7▲3.2±0.9 3.6±1.4*ALT（U/L）42.32±6.76 117.03±9.54*68.33±17.89▲55.86±17.23*▲AST（U/L）146.65±12.39 414.07±18.55*209.86±15.79▲179.65±21.66*▲

2.4 大鼠血清HA、LN、P3NP、CⅣ水平与空白组比较，模型组大鼠血清HA、LN、P3NP、CⅣ含量较高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，柔肝化纤颗粒组大鼠血清透HA、LN、P3NP、CⅣ含量均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.5 大鼠肝组织内SOD、MDA 水平与空白组比较，模型组大鼠肝组织内SOD降低，MDA含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，柔肝化纤颗粒组大鼠SOD降低，MDA含量降低（P＜0.05），差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清HA、LN、P3NP、CⅣ，肝组织SOD及MDA水平比较（±s）

表2 各组大鼠血清HA、LN、P3NP、CⅣ，肝组织SOD及MDA水平比较（±s）

注：*表示与空白组比较，P＜0.05；▲表示与模型组比较，P＜0.05；-表示无数值

组别空白组模型组秋水仙碱组柔肝化纤组鼠数12 10 11 11给药剂量--0.25 mg/kg 4 g/kg HA（mg/L）52.21±15.75 309.10±23.62*124.19±5.21▲111.21±13.81*▲LN（µg/L）6.27±2.03 38.45±0.88*11.21±1.21▲9.63±0.79*▲P3NP（µg/L）19.21±1.57 92.68±3.57*28.77±4.21▲29.02±1.75*▲CⅣ（µg/L）7.88±1.54 52.07±3.75*15.88±1.75▲13.25±1.56*▲SOD（u/L）211.51±12.76 122.53±7.68*169.11±3.26▲181.23±4.89*▲MDA（u/L）1.12±0.15 5.59±0.33*3.14±0.27▲2.23±0.19*▲

2.6 大鼠肝脏病理变化空白组大鼠肝细胞体积较大，核大而圆，核膜完整，位于细胞中央，肝细胞索以中央静脉为中心向四周呈放射状排列，肝细胞间连接紧密。模型组大鼠肝小叶界限不清，胞质内见大小不等多个的脂肪空泡，炎性细胞浸润，肝细胞排列紊乱。秋水仙碱组大鼠肝小叶结构明显改善，纤维间隔较少，可见少许肝细胞坏死、炎性细胞浸润，肝小叶多呈放射状分布，仅少数不完全性假小叶。柔肝化纤颗粒组肝组织结构明显改善，肝细胞脂肪变性减轻，少许炎性细胞浸润与假小叶形成。见图1。

图1 各组大鼠肝组织病理学表现（HE×20）

3 讨论

肝纤维化是各种慢性损肝因素（如肝炎病毒、脂肪肝、药物、毒物、酒精、血吸虫、胆汁淤积）等多种损伤因素长期刺激肝脏，造成的一种常见慢性肝脏疾病，损伤与修复过程中，细胞外基质的合成增加而降解减少，最终导致细胞外基质在肝内过度沉积。肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段，是所有慢性肝病的共同病理基础，肝纤维化有逆转的可能［11-12］。其形成的机制可能是通过某些致病因子（如肝炎病毒、脂肪肝、药物、毒物、酒精等）激活肝枯否氏细胞，进而分泌多种细胞因子，并与肝窦内皮细胞分泌多种细胞因子共同激活肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC），使其转化为肌成纤维细胞，使HSC 增殖，产生大量的细胞外基质，最终导致其在肝内大量沉积，逐渐形成肝纤维化［13-14］。CCl4诱发的肝纤维化典型动物造模，此造模方法能用于肝纤维化组织病理改变及抗纤维化药物筛选的相关体内研究［15］。当大鼠出现肝纤维化时，会表现为肝功能损伤、肝组织纤维样变等典型病变。

前期通过临床研究［16］发现，柔肝化纤颗粒可降低患者MDA 及血清纤维化各项指标的含量，增强GSH-PX、SOD 活性。病理学研究证实柔肝化纤颗粒有抗炎保肝、抗氧化应激及改善非酒精性脂肪性肝纤维化患者临床症状的作用。SOD 是一种抗氧化的酶，广泛存在于需氧有机体中，主要功能是避免氧化性损伤。MDA 是氧化应激常用的标志物，常被用来间接反映机体的自由基代谢变化及细胞的损伤程度。本研究结果显示，柔肝化纤颗粒能够显著降低肝脏组织中MDA 水平，减轻对机体的损伤。经柔肝化纤颗粒治疗后，肝脏组织中SOD 水平明显升高，使细胞有足够能力清除氧自由基，对抗过氧化反应，保护细胞膜免受自由基的攻击。通过检测实验大鼠血清中ALT、AST、HA、LN、P3NP、CⅣ含量，观察肝脏指数、肝脏病理组织学改变，发现柔肝化纤颗粒能明显改善CCL4肝纤维化模型大鼠肝脏肝纤维化、肝功能指标；同时使大鼠肝脏病理学组织的炎性浸润和脂肪空泡消失、汇管区无纤维素沉积，说明柔肝化纤颗粒具有保护肝脏的作用，为临床治疗提供了动物实验基础。

在壮医学中，肝纤维化属于“咪叠蛊”范畴，壮医的基础理论主要由“阴阳为本，天地人三气同步”的天人合一自然观、“三道”（气道、水道、谷道）“两路”（龙路、火路）的生理病理观、“毒虚致百病”的病因病机和“调气、补虚、祛毒”的治疗原则及“主药、公药、母药、帮药”的方剂配伍用药原则组成。柔肝化纤颗粒以生黄芪为主药，劲补后天脾气，又兼补肺健脾以通“气道”，利水托邪毒外出，振奋后天中州脾土之气，有“鼓舞脾脏之气，顾护中州，防止肝之邪毒向脾脏传变”之意；薏苡仁、泽兰、虎杖为公药，可利水渗湿、散瘀止痛解毒以通调“水道”；黄精、枸杞子、生牡蛎、鳖甲为母药，可补气养阴、滋补肝肾、益阴潜阳、软坚散结；鸡内金、橘红共为帮药，可行气消食健脾，兼补脾肾之精，通调“谷道”；黑枣调和诸药。诸药合用共奏攻毒补虚，柔肝化纤之效。壮医认为，“气道”“谷道”“水道”以通为用，三道通畅，调节有度，人体之气就能与天地之气保持同步协调平衡，机体就能呈现健康状态。柔肝化纤颗粒攻毒补虚，使三道通畅，天地人三气同步，体内阴阳平衡，确为治疗“咪叠蛊”（肝纤维化）之良方。

课题组前期研究［17-20］发现，柔肝化纤颗粒可抑制CCL4诱导的肝纤维化大鼠模型肝组织中基质金属蛋白酶-2 表达下降，细胞外基质沉积增多。研究发现：经CCL4诱导的大鼠肝纤维化模型肝组织活性氧类物质表达上调，磷酸化PKCα、细胞核Nrf2表达下调，转化生长因子-β1、I型胶原表达上调。柔肝化纤颗粒可上调CCL4诱导的肝纤维化大鼠模型肝组织PKCα 及细胞核Nrf2 表达，抑制活性氧类物质生成，下调肝组织转化生长因子-β1、I型胶原蛋白的表达［21-23］。基于前期研究，课题组认为柔肝化纤颗粒可能是通过降低HA、LN、P3NP、CⅣ含量，使ALT、AST 恢复正常，降低CCL4诱导肝纤维化大鼠血清中MDA和SOD含量，从而发挥其抗氧化作用，减轻肝纤维化严重程度的。但前期研究重在对现象进行描述，未能对其协同增效及深层次作用机制进行研究，这还需要在后期的研究中逐一完善，对其改善肝硬化、促进肝再生的作用机制仍需继续深入研究。