金龟子绿僵菌与杀虫剂对黄曲条跳甲联合毒力测定和保护酶活性影响

蒋春艳

（龙岩市农业科学研究所，福建 龙岩 364000）

0 引言

黄曲条跳甲Phyllotreta striolata （Fabricius）属鞘翅目叶甲科，是为害十字花科蔬菜的重要害虫［1］。成虫咬食叶片，造成孔洞，幼虫为害根部，并能传播土传病害，如细菌性软腐病和黑腐病等［2］。生产上，农民为了控制该虫的危害，加大了用药量，提高了用药频率，从而加剧了抗性的发展，近年来，黄曲条跳甲被认为是最难防治的蔬菜害虫之一［3］。

长期以来，黄曲条跳甲主要以化学药剂防治为主。近年来也有应用生物防治真菌来防治黄曲条跳甲方面的研究，何越超［4］测定了8株金龟子绿僵菌对黄曲条跳甲的致病力，筛选出了对黄曲条跳甲致病力较强的一株菌株。同其他生物防治真菌一样，绿僵菌杀虫速度较慢，制约了它的田间应用［5］。有学者研究了绿僵菌与其他杀虫剂的兼容性，企图用其与杀虫剂配伍来减少药剂使用浓度、缩短害虫的死亡时间和提高绿僵菌的防效［6］。

昆虫病原真菌与常用杀虫剂的相容性是害虫综合防治体系中的重要研究内容，对减少农药用量、简化病虫害防控技术、提高防治效果和降低应用成本等都具有重要的应用价值［7］。目前，对于利用金龟子绿僵菌和其他杀虫剂配伍来防治黄曲条跳甲的报道不多，配伍后对其体内保护酶活性方面的研究也少见报道。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是生物体内重要的保护酶。SOD是生物细胞内最重要的清除自由基的酶，与生物体的自身防御和对杀虫剂的耐药性、抗逆性有关［8］；POD的主要功能是催化过氧化物对各种物质的氧化，可以通过消除毒性物质和过氧化氢，对细胞起到保护的作用；CAT在生物演化的过程中可通过催化细胞内的过氧化氢的分解而防止其过氧化，从而起到防御的作用［9］。酶抑制剂与某些常用杀虫剂混用可提高对抗性黄曲条跳甲成虫的防治［10］，有利于研究出新的防治方法。本研究开展了金龟子绿僵菌制剂与杀虫剂配伍防治黄曲条跳甲，以期提高绿僵菌制剂的防治效果，为金龟子绿僵菌混合制剂的生产应用提供参考依据，也为黄曲条跳甲的防治提供新方法；同时，测定了黄曲条跳甲体内保护酶活性变化，确定了黄曲条跳甲感染混合药剂后虫体的调节机制及保护酶系统在虫体免疫中的作用机理，为防治工作提供了理论基础。

1.1 材料与方法

1.1.1 供试材料 供试作物：福建省龙岩市农科所大棚种植的上海青。

供试虫源：黄曲条跳甲成虫采集于福建省龙岩市十字花科蔬菜地，室内以新鲜没使用过任何农药的上海青叶片连续饲养72 h后进行毒力测定。

供试药剂及试剂盒：80亿孢子/mL金龟子绿僵菌CQMa421可分散油悬浮剂（重庆聚立信生物工程有限公司）、10%阿维菌素悬浮剂（华北制药集团爱诺有限公司）、8000 IU/μL苏云金杆菌悬浮剂（山东鲁抗生物农药有限责任公司）、2.5%鱼藤酮乳油（南通神雨绿色药业有限公司）、0.3%印楝素乳油（成都绿金生物科技有限责任公司）；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、过氧化物酶（POD）试剂盒、过氧化氢酶（CAT）试剂盒，试剂盒均为苏州科铭生物技术有限公司产品。

1.1.2 实验方法 金龟子绿僵菌CQMa421配制成浓度为1.0×108个孢子/mL可分散油悬浮剂，阿维菌素悬浮剂浓度梯度为0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/L，苏云金杆菌悬浮剂浓度梯度为1.92×108、3.84×108、7.68×108、1.54×109、3.07×109IU/L，鱼藤酮乳油浓度梯度为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/L，印楝素乳油浓度梯度为0.03、0.06、0.12、0.24、0.48 mg/L。将配制好的金龟子绿僵菌CQMa421分别与其他4种药剂各浓度混合，制成混合药剂。

药剂室内毒力测定采用浸叶法。参照国际抗性行动委员会的浸叶法（IRAC，1990），采集未施用任何药剂的新鲜上海青叶片，分别在以上单剂、混合药液中浸渍约15 s后取出，于通风处自然晾干后置于透明塑料瓶中，接入虫龄大小一致的黄曲条跳甲成虫，每个浓度3个重复，每个重复30头成虫，用80目防虫网封口并置于温度25（±1） ℃、相对湿度70%~80%，光周期14L∶10D的人工气候箱内，以清水作空白对照。药剂处理后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h后检查死亡虫口数，计算死亡率和联合作用结果。

混剂理论死亡率公式为：

其中：Pa、Pb分别为各单剂的试虫死亡率。

协同毒力指数（c.f）公式为：

使用以上混合药剂以相同方法处理一定数量的黄曲条跳甲成虫，以清水作空白对照，每24 h取样1次，连续取样5次，测定黄曲条跳甲体内SOD、POD、CAT 3种保护酶活性，每处理重复3次。测定具体实验步骤和计算方法参考试剂盒说明书。

1.2 数据处理

试验结果采用Excel 2007进行数据统计，DPS软件进行方差分析和多重比较差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 混合药剂对黄曲条跳甲毒力测定结果

通过统计120 h内死亡的虫口数，根据公式计算，判断增效与否。以c.f值大小来定性评判2种药剂混用的联合作用，其中c.f≥20时为增效作用，c.f≤-20时为拮抗作用，-20＜c.f＜20时为相加作用。最后筛选出效果最佳的混配制剂。结果表明（表1），在120 h时，浓度为1.0×108个孢子/mL金龟子绿僵菌与阿维菌素、苏云金杆菌、鱼藤酮、印楝素不同浓度的混配剂中，金龟子绿僵菌与阿维菌素和苏云金杆菌各浓度混配都有增效和相加的效果，其中效果最好的是浓度为1.0×108个孢子/mL金龟子绿僵菌与浓度为1.92×108IU/L苏云金杆菌混配剂，协同毒力指数达到了165.0，其次为金龟子绿僵菌与低浓度的阿维菌素混配剂，协同毒力指数为96.0；金龟子绿僵菌与低浓度的鱼藤酮混配也有增效作用，协同毒力指数为60.5，效果排第3。金龟子绿僵菌与印楝素各个浓度混配后，联合作用结果都是拮抗作用。因此，金龟子绿僵菌与4种药剂混配后，效果最好、毒力最强的是金龟子绿僵菌+苏云金杆菌。

表1 金龟子绿僵菌与杀虫剂混配对黄曲条跳甲毒力测定联合作用结果

2.2 混合药剂对黄曲条跳甲体内保护酶活性影响

2.2.1 混合药剂对黄曲条跳甲体内SOD活性影响金龟子绿僵菌与4种杀虫剂混用对黄曲条跳甲SOD活性影响如表2所示。在处理24 h时，金龟子绿僵菌与苏云金杆菌所有混合处理中，除与浓度3.84×108IU/L和1.54×109IU/L混合SOD活性显著低于对照外，与其他浓度混合SOD活性都显著高于对照，金龟子绿僵菌与苏云金杆菌最低浓度1.92×108IU/L混合时SOD活性最高，为190.270 U/g鲜重；金龟子绿僵菌与鱼藤酮混合处理后，浓度为0.1 mg/L、0.2 mg/L时，SOD活性显著高于对照，分别为185.575 U/g和176.567 U/g鲜重。药后48 h时，金龟子绿僵菌与阿维菌素混合的各个浓度SOD活性上升到最高，均显著高于对照，随后下降。以上几个处理对黄曲条跳甲防控作用较好，其中金龟子绿僵菌与苏云金杆菌最低浓度1.92×108IU/L混合时效果最好。

表2 金龟子绿僵菌与杀虫剂混用对黄曲条跳甲SOD活性的影响

2.2.2 混合药剂对黄曲条跳甲体内POD活性影响金龟子绿僵菌与4种杀虫剂不同浓度混合处理黄曲条跳甲后，120 h内其体内POD活性均出现升高的现象，部分处理呈现先升高后下降的趋势，对照处理处于相对平衡状态（表3）。金龟子绿僵菌与阿维菌素各浓度混合处理后出现先上升后下降的趋势，浓度为0.01 mg/L混合处理96 h时，POD达到最高值，为666.667 U/g鲜重，48 h时各浓度POD活性均显著低于对照，可能是受到侵害的初期机体还未启动防御系统使POD活性降低，而后为了维持机体正常生理功能，POD活性逐渐上升；金龟子绿僵 菌 与 浓 度 为1.92×108IU/L和3.84×108IU/L苏云金杆菌混合处理在120 h时达到最大值，分别为1573.333 U/g和1313.333 U/g鲜重，均显著高于对照；金龟子绿僵菌与鱼藤酮混合处理后POD活性均在120 h时达到最大值；与印楝素各浓度处理中，除浓度为0.48 mg/L混合处理外，其余浓度混合处理均在120 h时达到最大值，且显著高于对照。

表3 金龟子绿僵菌与杀虫剂混用对黄曲条跳甲POD活性的影响

2.2.3 混合药剂对黄曲条跳甲体内CAT活性影响 混合药剂对黄曲条跳甲体内CAT活性影响如表4所示，金龟子绿僵菌与4种杀虫剂混合处理黄曲条跳甲120 h内，其体内CAT活性呈现先下降后升高再下降的趋势。金龟子绿僵菌与阿维菌素各浓度混合处理后，浓度为0.01、0.02、0.04 mg/L时在48~72 h内CAT活性下降，96 h时达到最大值，随后再次下降，其中与浓度为0.01 mg/L混合处理96 h时CAT活性达到最大值，为230.207 nmol/min/g鲜重，显著高于对照；金龟子绿僵菌与苏云金杆菌各浓度混合处理后，24 h时显著高于对照，与浓度为1.92×108IU/L苏云金杆菌混合处理后CAT活性达396.237 nmol/min/g鲜重；金龟子绿僵菌与鱼藤酮各浓度混合处理后在120 h时CAT活性达到最高值，说明该混合药剂在120 h时才充分发挥药效。

表4 金龟子绿僵菌与杀虫剂混用对黄曲条跳甲CAT活性的影响

3 讨论

在蔬菜生产中，农民为了控制黄曲条跳甲产生的危害，依然采用大量或单一化学药剂进行控制，这样不仅使蔬菜上农药残留量增加，危害人类健康，还加剧了黄曲条跳甲抗性的发展，进而又继续增大用药量，形成了恶性循环。将微生物制剂与杀虫剂混合使用是众多生物防治制剂开发普遍采用的模式，这样可以提高杀虫效果，减少化学农药的用药量，减缓抗药性的产生，达到节约成本和绿色农业的效果［11］，对保护环境和防御其他天敌也具有重要的意义［12］。本研究使用低剂量的生物防治真菌金龟子绿僵菌CQMa421分别与4种低毒杀虫剂不同浓度混合，对黄曲条跳甲进行了室内联合毒力测定和防御机制研究，筛选出了对黄曲条跳甲防控较好的混配剂，即1.0×108个孢子/mL金龟子绿僵菌+1.92×108IU/L苏云金杆菌、1.0×108个孢子/mL金龟子绿僵菌+0.01 mg/L阿维菌素，为金龟子绿僵菌混合制剂在生产上防治黄曲条跳甲提供了参考依据。