HS-SPME 结合GC×GC-TOF-MS 分析茶曲清香型白酒中的挥发性香气组分

关玉权，薛锡佳，陈兴杰，杜先锋，杨金玉，李 增，高志远，程 伟

（1.安徽金种子酒业股份有限公司，安徽阜阳 236023；2.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥 230036）

中国白酒以高粱等谷物为原料，采用酒曲（大曲、小曲、麸曲）为糖化发酵剂，经复杂的酶化学反应、生化反应、有机化学反应及微生物代谢活动等发酵过程酿制而成，其中，酒曲是微生物、粗酶和风味物质的重要载体。中国白酒的制曲、酿酒、风味及微生物等方面还有待于深入研究。大曲清香型白酒通常以低温大曲作为糖化发酵剂，采用“两遍清”的酿造工艺，地缸作为发酵容器，突出乙酸乙酯和己酸乙酯为主体的花果样香气。茶作为重要的传统饮品，含有茶多酚、咖啡碱和多糖类等对人体有益的组分。茶酒是指以茶叶为主要原料，采用浸泡或发酵的工艺制备而成的饮用酒的统称。夏秋茶是相对于春茶的一大类茶，不适宜制作绿茶。夏秋茶具有典型的茶香特点，尝试将夏秋茶与传统大曲结合制成含茶大曲，然后将夏秋茶大曲应用在酿造固态白酒过程中，以期得到具有“独特茶香、保留传统酒香、口感醇和、酒体清澈透明”的固态发酵型茶酒。

全二维气相色谱联合飞行时间质谱(two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC×GC-TOF-MS)技术相较于传统的一维气相色谱（1D-GC），具有分辨率高、灵敏度高、峰容量大等显著特点，是进行复杂样品中挥发性组分分离鉴定的重要工具。顶空固相微萃取（HS-SPME）作为复杂样品中挥发性组分分析重要的前处理方法之一，具有无需溶剂且操作简单快速等特点，已广泛应用于食品中各种微量成分的富集。当前，GC×GC-TOF-MS 技术已广泛应用到白酒香气组分的分离鉴定等方面的研究,然而，关于固态发酵型茶酒中挥发性香气组分的GC×GCTOF-MS 分析还鲜有报道。本实验采用HSSPME-GC×GC-TOF-MS 技术对固态发酵型茶酒中的挥发性香气组分进行检测并对比分析，有助于增进对茶酒香气特点及特征组分的认识，为固态发酵型茶酒的开发与组分特征评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：固态发酵型茶酒（原酒），优级酒（酒精度63.0%vol，以下简称SF-CJ），安徽金种子酒业股份有限公司提供；采用夏秋茶为辅料培养的中低温大曲作为糖化发酵剂，再采用大曲清香型白酒酿造工艺酿造清香型白酒。

试剂：氯化钠、无水硫酸钠等（化学纯），中国医药集团化学试剂有限公司。

仪器设备：全二维气相色谱-飞行时间质谱仪(GC×GC-TOF-MS，Pegasus4D Leco Corporation，USA)系统：7890A 气相色谱仪（美国Agilent 公司），Pegasus 4D 飞行时间质谱联用仪（美国LECO 公司），其中，GC×GC 柱系统的第一维柱采用DBWAX(30 m×250 μm×0.25 μm)，第二维柱采用DB-17MS(2 m×100 μm×0.10 μm)；57330-U 手动SPME进样器(美国Supelco 公司)；2 cm 50/ 30 µm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取头(美国Supelco 公司)；Mili-Q Advantage超纯水系统(美国Millipore公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验酒样的前处理

用去离子水将实验酒样SF-CJ 的酒精度稀释到10.0%vol，置于4 ℃普通冰箱，保存备用。

1.2.2 顶空固相微萃取方法(HS-SPME)

参照GAO W J 等人的方法，调整了萃取时间：取5 mL 酒样加入到20 mL 的顶空瓶中，加盖密封；采用DVB/CAR/PDMS纤维头，对顶空瓶中的样品进行SPME 萃取；在50 ℃条件下恒温15 min，再萃取30 min 后，将萃取头立即插入250 ℃的GC 进样口解吸附5 min，再进行GC×GC-TOF-MS 分析，相同条件下进样3次。

1.2.3 仪器方法(GC×GC-TOF-MS)

参照陈双等的方法，第一维柱进样温度250 ℃，初始温度40 ℃保留5 min，以5 ℃/min 升至220 ℃，以20 ℃/min升至250 ℃，保留2.5 min，氦气(99.999 9%)1.0 mL/min，无分流；第二维柱的柱温高于第一维柱5 ℃，调制解调器温度始终保持高于第一维柱5 ℃；全二维分析调制周期4.0 s，接口温度270 ℃，离子源温度250 ℃，电子轰击源70 eV，检测器1680 v，采集率50 张/s，质谱扫描范围m/z 29～500，采用NIST谱库比对。

质谱条件：EI 离子源，电压70 eV，离子源温度230 ℃，传输线温度280 ℃，检测器电压1365 V，采集质量数范围35～500 amu、频率100 spectrum/s，由LECO公司Pegasus4D工作站控制数据采集。

1.2.4 GC×GC-TOF-MS的数据处理

采集的TOF-MS 数据由LECO 公司Chroma TOF 工作站自动识别信噪比大于50 的色谱峰，并与NIST 14和Wiley 9质谱库比对，经人工解谱与同系物二维色谱出峰规律比对后去除烷烃类等化合物；选择相似度与反相似度均大于700，且可能性大于4000 的化合物，在Chroma TOF 软件中建立保留指数计算方法；确定化合物一维色谱柱保留指数，再比对文献报道的保留指数，最后选择数值差异在不大于50的化合物作为鉴定结果（参照高梦昕等的方法，作为数据处理依据）。

2 结果与分析

2.1 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS 法对白酒挥发性香气组分的分离特性

全二维色谱分离极大地拓展了传统一维色谱的分离能力，还具有灵敏度高、分辨率高等优点。飞行时间质谱的采集频率较高，可实现与全二维气相色谱的联用，极大地提高检测灵敏度。当前，GC×GC-TOF-MS 技术已应用于白酒检测领域，洪泽淳等基于GC×GC-TOF-MS 技术研究了酱香型白酒风味成分；周茜等总结了GC×GC-TOFMS 技术在酒类分析中的应用；季克良等采用GC×GC-TOF-MS 技术对酱香型白酒的微量成分进行了分析。然而，关于固态发酵型茶酒中挥发性香气组分的GC×GC-TOF-MS分析还鲜有报道。

本实验采用HS-SPME-GC×GC-TOF-MS 技术对酒样SF-CJ 中的挥发性香气组分进行检测并对比分析，如图1 所示的全二维分析谱图表明，酒样SF-CJ 中的挥发性组分较为复杂，一维色谱图中有部分化合物出现共流出现象，通过二维色谱后获得了一定的分离效果，但仍存在少量的共流出现象，还需要进一步分析原因。

图1 酒样SF-CJ经HS-SPME-GC×GC-TOF-MS分析的1D总离子流色谱图与2D总离子流色谱图(图中黑点表示一个色谱峰)

2.2 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS 法对酒样SF-CJ挥发性香气组分的鉴定

当前，市场上流通的茶酒大部分是配制型工艺，其香气和口感与固态发酵白酒相比均有不同程度的欠缺，将茶叶作为原辅料酿造固态发酵型茶酒的研究并不多。茶与酿酒工艺的结合可能创新白酒品类或酿造过程产生新的香气物质，陈琳琳等在蒸馏茶酒中检测到有新的香气物质产生，该物质是否来源于茶叶中的醇类物质与白酒中的酸类物质发生的反应还有待深入研究；邱新平等也在发酵型茶酒中检测到了新的香气物质。金种子酒业采用夏秋茶为辅料培养中低温大曲，再根据大曲清香型白酒的酿造工艺酿造茶曲清香型白酒，提供了茶酒品类开发的新思路。

本实验采用固态发酵型茶曲清香型白酒（原酒）作为实验酒样（酒样SF-CJ），进行挥发性香气组分分析。如表1 所示，在酒样SF-CJ 中共确认了可信度较高的挥发性组分261 种，主要包括酯类62种，醇类49 种，酸类36 种，醛、酮、缩醛类34 种，含氮化合物11 种，呋喃类21 种，含硫化合物11 种，芳香族22种，其他类16种。

表1 酒样SF-CJ经HS-SPME-GC×GC-TOF-MS分析鉴定出的化合物统计(种)

综上表明，酒样SF-CJ 中主要挥发性香气组分包括酯类、醇类、酸类、醛酮类等化合物，其中，多数酯类物质具有花果香气，醇类和酸类物质赋予酒体醇甜的感官，各类挥发性香气组分的复合形成了酒样SF-CJ 的独特感官及风格特征。某些呋喃、芳香族及部分酯类化合物通常具有特殊香气及生理功能，虽然其在酒体中的种类和含量较少，也对酒体的复合香气具有重要作用。因此，本文着重对比分析了鉴定出的呋喃、芳香族及部分酯类化合物。

2.2.1 呋喃类化合物

呋喃类化合物是许多天然食品香气特征的重要成分，具有特殊香气和生理功能。呋喃类化合物也是白酒中重要的呈香物质，研究表明，呋喃类化合物是酱香型白酒的重要呈香物质和特征化合物。由表2 可知，酒样SF-CJ 中共鉴定出21 种呋喃类化合物，其中，乙酸糠酯具有果香、药香、辛香；苯并呋喃具有抗菌，抗肿瘤和抗炎等生物作用；糠醛具有特殊香气，其含量对酒体的香气有重要影响，在多种香型的白酒中均检测到糠醛。综上，具有特殊香气或生理功能的乙酸糠酯、苯并呋喃等呋喃类化合物均可以作为SF-CJ中重要的香气组分。

表2 酒样SF-CJ经HS-SPME-GC×GC-TOF-MS分析鉴定出的呋喃类化合物

2.2.2 芳香族化合物

芳香族化合物是一类碳氢化合物，是一类从植物胶中获得的具有芳香气味的物质。由表3 可知，酒样SF-CJ 中共鉴定出21 种芳香族化合物；其中，蓝烃具有芳香性，具有抗菌、抗真菌与抗发炎、镇痛的效果；苯乙酸乙酯作为合成香料，具有显著而甜蜜的玫瑰花香，较普遍用于烟、皂、日用化妆品的香精中；苯乙醇具有清甜的玫瑰样花香，这与酒样SF-CJ 具有“特殊的花香、蜜香”等香气感官相吻合。综上表明，具有特殊香气或生理功能的蓝烃、苯乙酸乙酯、苯乙醇等芳香族化合物均可作为SFCJ中重要的香气组分。

表3 酒样SF-CJ经HS-SPME-GC×GC-TOF-MS分析鉴定出的芳香族化合物

夏秋茶中的多酚、花青素、咖啡碱类等物质含量较高，这类物质在制曲过程中有可能被微生物利用转化或者影响制曲微生物的类群与代谢，含有这类物质或新转化和生成物质的茶曲再通过白酒固态发酵得到固态发酵型茶酒，涉及的重要微生物及关键代谢产物等还有待于深入研究。采用夏秋茶培养的茶曲，微生物群落结构及其代谢产物与酶类明显区别于传统大曲，大曲的品质与风味组分也有差异。将夏秋茶大曲应用于酿造固态过程中，得到具有“独特茶香、保留传统酒香、口感醇和、酒体清澈透明”的固态发酵茶酒，茶叶中的芳香族化合物在制曲、酿酒等过程中的转化对茶酒的香气形成具有重要影响。

2.2.3 酯类化合物（部分）

酯类化合物是白酒挥发性成分中最重要的化合物，是白酒中主要的挥发性成分。酒样SF-CJ 中除乙酸乙酯（具有溶剂状香）、乳酸乙酯（具有椰子香）、己酸乙酯（具有甜苹果香）、辛苯乙酸乙酯（具有玫瑰和蜜香）等含量较高的酯类物质外，还含有如表4 所示的19 种特殊酯类物质，其中己酸甲酯具有令人愉快的气味。

表4 酒样SF-CJ经HS-SPME-GC×GC-TOF-MS分析鉴定出的酯类化合物(部分)

固态发酵型茶酒酿造过程中，茶叶或茶曲中的大部分营养、香气及功效成分都直接或间接参与酿酒发酵并溶于酒体，蒸馏得到的茶酒有可能兼具茶和白酒的特点，具有一定的药理或保健功效。固态发酵型茶酒在口感上与浸泡或调制型茶酒相比也具有突出的优势，固态发酵型茶酒既有茶叶的清香，也有白酒的醇厚，其中，酯类物质的产生也可能受到茶叶中特殊组分的影响，进而在白酒发酵体系中形成有别于传统发酵白酒的新型酯类物质。综上表明，除乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、辛苯乙酸乙酯等含量较高的酯类物质外，具有特殊香气的己酸甲酯等芳香族化合物也可作为SF-CJ 中重要的香气组分。

3 结论

目前，白酒香气特征研究主要侧重于挥发性组分分析等方面，伴随着样品前处理方法的日益丰富与创新发展，以及新型高端精密检测分析仪器的广泛应用，基于风味组学技术对白酒微量成分构成与含量分析的研究也在不断深入。香气特征是白酒品质的重要组成部分，挥发性组分是构成清香型白酒独特香气的重要部分，因此，研究特征香气组分对调控茶曲清香型白酒的品质具有重要意义。发酵型茶酒的生产工艺较复杂，从茶酒市场长远的发展方向来看，发酵和配制等工艺相结合而制备的茶酒有利于更好地提高茶酒的口感和品质，对茶酒的香气组分及特征性组分进行检测分析对茶酒行业的发展具有重要意义。

本实验采用HS-SPME-GC×GC-TOF-MS 法检测酒样SF-CJ 中的挥发性香气组分，得到的结论主要有：（1）在酒样SF-CJ 中共确认了可信度较高的挥发性组分261 种，主要包括酯类62 种、醇类49种、酸类36 种、醛酮缩醛类34 种、含氮化合物11种、呋喃类21 种、含硫化合物11 种、芳香族21 种和其他类16 种；（2）酒样SF-CJ 中鉴定出的多种特殊挥发性香气组分，如苯并呋喃、乙酸糠酯、蓝烃、苯乙酸乙酯、苯乙醇等，均可作为酒样SF-CJ 中的重要香气组分。本研究为固态发酵型茶酒的开发与组分特征评价提供依据，有利于促进茶酒行业的发展。