海水酸化和铁离子对中肋骨条藻光化学活性的影响

张达娟，毕相东，张树林，戴伟，王雪莹

(天津农学院 水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384)

随着工业进程的加快和人们生活水平的提高，化石燃料的大量使用导致大气中CO2含量持续增加。海洋作为CO2重要的汇，以每小时100万t以上的速率从大气中吸收CO2[1]，经过一系列反应使海水H+浓度增加、pH降低，从而引起海水酸化。工业革命前，全球海洋的平均pH为8.2，目前已降至8.1，至21世纪末预计将再降低0.25个pH单位，pH每降低1个单位，海水中H+浓度会升高10倍[2]，海水pH若降低0.25个单位，H+浓度将比工业革命前增加125%，依赖于海洋环境的浮游生物将受到一定的影响[3]，甚至通过食物链放大影响。

海水酸化对不同浮游植物的影响还受其他环境因子的影响，如海水温度升高[9-11]、紫外线增强[8,12-13]和金属离子浓度改变等。其中，Fe作为重要的金属离子，一直作为研究重点，伴随酸化发生，海水pH降低，其中游离Fe离子浓度会相应增加[14]，Fe(Ⅱ)的稳定性提高，Fe(Ⅲ)溶解度发生改变[15]，其生物可利用度会增加[16]。大量“铁假说”试验表明，在太平洋东北部高营养盐、低叶绿素a海域中投放Fe，会促进浮游植物的生长，提高其生物量[17]，海水酸化通过影响浮游植物对Fe离子的吸收利用而间接影响其生长[18]。近岸海域Fe离子浓度较大洋高，一般为十几到几十纳摩尔每升水平[19]，对浮游植物的影响更为复杂。本研究中，为进一步探讨酸化和Fe离子对浮游植物的影响，选择近海常见浮游植物中肋骨条藻Skeletonemacostatum作为受试种类，通过测定其叶绿素荧光参数，阐明CO2酸化和Fe离子对中肋骨条藻细胞光化学活性的影响，以期为评估海水酸化背景下中肋骨条藻的生理生态响应特征提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

中肋骨条藻购于上海光语生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藻种的培养 选用f/2培养基[20]，培养温度(22±2)℃，光照强度为(80±10)μmol/(m2·s)，光暗比为12L∶12D。

1.2.2 酸化海水的制备

人工海水的制备:为避免自然海水中Fe离子对试验结果的影响，本研究中所用海水为人工海水[21]，除FeCl3·6H2O有变外其他成分保持不变。

酸化海水的制备:试验设1个对照组和1个处理组，均为人工海水配制的不含Fe离子的f/2培养基，分别向对照组和处理组中通入CO2含量为0.038%(2013年全球大气CO2含量平均水平，NOAA/ESRL)和0.08%(2100年大气平均CO2含量预测水平[22])的混合气体(购自天津安利达气体有限公司)。气体流量用流量计控制在300 mL/min，利用pH计监测培养基中pH变化情况，待到pH稳定后酸化海水制备完成。不同CO2含量的混合气体中氧气含量均为21.00%，氮气含量分别为78.96%和78.92%。

1.2.3 Fe(Ⅲ)浓度(均为质量浓度，下同)的设定 配制FeCl3·6H2O母液，在酸化处理后，取一定量的FeCl3·6H2O母液，使不同酸化组内均包含1.5、2.0、3.0、4.0 μg/L 4个Fe(Ⅲ)浓度。

1.2.4 试验设计 试验开始前3 d，将中肋骨条藻转移至不含Fe(Ⅲ)的培养基中暂养，使吸附在藻细胞上的Fe(Ⅲ)消耗代谢完毕。每个CO2水平设4个Fe(Ⅲ)浓度组，每组设3个平行。试验用培养液制备完成后接种中肋骨条藻，各组初始密度均为5×105cells/mL。接种后，对藻液持续通入相应混合气体直至试验结束，气体流量为300 mL/min。试验共进行6 d，每隔24 h取样一次，用于测定各组细胞密度及相关叶绿素荧光诱导动力学参数。

1.2.5 叶绿素荧光参数的测定 用叶绿素荧光分析仪(Phyto-PAM, Walz, 德国)测定中肋骨条藻叶绿素荧光参数:初始荧光(F0)、最大荧光(Fm)、稳态荧光(Fs)、光适应下最大荧光(Fm′)和最大电子传递速率(rETR),具体操作参考张媛媛等[23]的方法，然后根据下式计算最大光能转化效率(Fv/Fm)、实际光能转化效率(ΦPSⅡ)和有效光能转化效率(Yield)：

Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm，

(1)

ΦPSⅡ=(Fm′-Fs)/Fm′，

(2)

Fv′=Fm′-F0′，

(3)

Yield=Fv′/Fm′，

(4)

F0′=1/(1/F0-1/Fm+1/Fm′)。

(5)

1.3 数据处理

试验数据均以平均值±标准差(mean±S.D.)表示。采用 SPSS 19.0软件进行双因素方差分析(two-way ANOVA)，分析海水酸化和不同Fe(Ⅲ)浓度对中肋骨条藻各叶绿素荧光参数的影响，若存在CO2含量和Fe(Ⅲ)的交互作用，则对相同CO2含量水平下不同Fe(Ⅲ)浓度组进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比较(Tukey)。利用独立样本T检验分析相同Fe(Ⅲ)浓度条件下不同酸化处理之间的差异性。显著性水平设为0.05,极显著水平设为0.01。

2 结果与分析

2.1 海水酸化和Fe(Ⅲ)对中肋骨条藻生长的影响

从图1可见:CO2含量、Fe(Ⅲ)浓度及二者的交互作用均对中肋骨条藻细胞密度有显著性影响(P<0.05)；CO2含量为0.038%时，各Fe(Ⅲ)浓度组藻细胞密度自第4天开始显著升高(P<0.05)，至培养结束时，1.5、2.0 μg/L Fe(Ⅲ)处理组藻细胞密度分别为12.09×105、15.06×105cells/mL，显著高于3.0、4.0 μg/L Fe(Ⅲ)处理组(P<0.05);CO2含量为0.08%时，不同浓度的Fe(Ⅲ)对中肋骨条藻生长自培养第1天开始就具有显著性影响(P<0.05)，Fe(Ⅲ)浓度分别为3.0、4.0 μg/L时，其生长速度较快，至培养结束时，中肋骨条藻细胞密度分别为14.48×105、12.89×105cells/mL，显著高于1.5、2.0 μg/L Fe(Ⅲ)处理组(P<0.01)，但与CO2含量为0.038%时1.5、2.0 μg/L Fe(Ⅲ)处理组的细胞密度基本持平。

标有不同字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)。

独立样本T检验表明，当Fe(Ⅲ)浓度分别为1.5、2.0 μg/L时，0.038% CO2组中藻细胞密度显著高于0.08% CO2组(P<0.05)，但当Fe(Ⅲ)浓度分别为3.0、4.0 μg/L时，0.038% CO2组中藻细胞密度则显著低于0.08% CO2组(P<0.05)。

2.2 海水酸化和Fe(Ⅲ)对叶绿素荧光参数的影响

海水CO2含量、Fe(Ⅲ)浓度及二者的交互作用均在培养的第1天开始对中肋骨条藻叶绿素荧光参数产生极显著影响(P<0.01)，并持续至试验结束(表1)。CO2含量为0.038%时，不同Fe(Ⅲ)浓度处理组中肋骨条藻Fv/Fm、ΦPSⅡ、Yield和rETR变化趋势基本相同，从第4天开始，不同浓度的Fe(Ⅲ)对叶绿素荧光参数均产生显著的促进作用(P<0.05)(表2)；CO2含量为0.08%时，浓度为1.5、2.0 μg/L的Fe(Ⅲ)对中肋骨条藻叶绿素荧光参数均产生显著的抑制作用(P<0.05)，且抑制作用在培养第1天时就开始出现，而浓度为3.0、4.0 μg/L的Fe(Ⅲ)则具有显著的促进作用(P<0.05)(表3)。

表1 海水酸化和不同Fe(Ⅲ)浓度对中肋骨条藻光合系统Ⅱ各指标影响的双因素分析

相同Fe(Ⅲ)浓度下，海水酸化(0.08% CO2)对中肋骨条藻叶绿素荧光参数的影响存在一定差异。当Fe(Ⅲ)浓度分别为1.5、2.0 μg/L时，海水酸化总体上对中肋骨条藻叶绿素荧光参数均存在显著的抑制作用(P<0.05)，用1.5 μg/L Fe(Ⅲ)处理至培养结束时，酸化组的Fv/Fm、ΦPSⅡ、Yield和rETR比0.038% CO2组分别降低46.6.%、61.4%、49.2%和60.0%；当Fe(Ⅲ)浓度分别为3.0、4.0 μg/L时，海水酸化对中肋骨条藻叶绿素荧光参数略有促进作用，用4.0 μg/L Fe(Ⅲ)处理至培养结束时，酸化组中Yield和rETR分别比0.038% CO2组高1.3%和2.1%，但无显著性差异(P>0.05)(表2、表3)。

表2 0.038% CO2处理组Fe(Ⅲ)浓度对中肋骨条藻叶绿素荧光参数的影响

表3 0.08% CO2处理组Fe(Ⅲ)浓度对中肋骨条藻叶绿素荧光参数的影响

3 讨论

3.1 海水酸化对中肋骨条藻生长的影响

3.2 Fe(Ⅲ)对中肋骨条藻生长的影响

Fe离子是浮游植物生命过程中必需的微量营养元素，是其生长的重要限制因子之一。Fe离子浓度过低，会使光合作用传递链中所有含Fe离子的细胞色素含量下降，藻类PSⅡ的光合作用效率及能量转化效率显著下降[29]。在缺Fe离子条件下，三角褐指藻的Fv/Fm显著降低，而重新加入Fe离子24 h后，Fv/Fm恢复到原来水平[30]；Fe离子浓度为10-9～10-6mol/L时，随着Fe离子浓度的增加，对尖刺菱形藻Pseudonitzschiapungens光合放氧和叶绿素合成起到促进作用[31]。本研究中，在CO2含量为0.038%的条件下，不同浓度的Fe(Ⅲ)从第4天开始对中肋骨条藻的各叶绿素荧光参数产生显著的促进作用；海水酸化(CO2含量0.08%)后，1.5、2.0 μg/L Fe(Ⅲ)对中肋骨条藻各叶绿素荧光参数自第1天开始产生显著的抑制作用，并持续至培养结束，而Fe(Ⅲ)浓度为3.0、4.0 μg/L的组中肋骨条藻相应叶绿素荧光参数指标水平与CO2含量0.038%时低浓度Fe(Ⅲ)(1.5、2.0 μg/L)组相当，Fe(Ⅲ)对其光合作用的影响快于对生长的影响，推测是浮游植物首先通过光合作用准备足够的物质和能量，而后生长才能进行。而在CO2含量为0.08%的酸化条件下，低浓度Fe(Ⅲ)抑制其正常的光合反应过程，这可能是由于酸化条件下浮游植物对Fe离子的吸收率降低[18]、细胞膜氧化还原特性及相关酶活性改变[8]引起的，而高浓度Fe(Ⅲ)则可通过增大捕光色素复合体的面积来促进光吸收，进而提高光合作用速率及生长。

浮游植物通过光能来同化无机碳的过程是海洋物质循环和能量流动的重要基础，它们把溶解态CO2转化为颗粒态，是“生物泵”的一个重要生物学过程。海洋从大气中吸收CO2的量依赖于生物泵，也依赖于酸化所产生的效应。海水酸化和其他环境因子对浮游植物的影响与其种类特性、细胞大小及对环境适应能力有关，海洋酸化对浮游植物生理过程影响的差异必然会引起浮游植物群落结构变化。

4 结论

1)CO2含量为0.038%条件下，较低Fe(Ⅲ)浓度可以显著促进中肋骨条藻生长，海水酸化(CO2含量0.08%)后，需要较高Fe(Ⅲ)浓度才能保持相似增长水平。

2)CO2含量为0.038%条件下，中肋骨条藻细胞PSⅡ光化学活性随Fe(Ⅲ)浓度升高而增加；海水酸化(CO20.08%)后，仅Fe(Ⅲ)浓度为3.0、4.0 μg/L时对光化学活性表现出促进作用，并与0.038% CO2含量下相当；相同Fe(Ⅲ)浓度下，酸化会引起藻细胞PSⅡ光化学活性降低。