实时荧光RT-PCR方法检测新型冠状病毒核酸结果分析

汪鹏

摘要：目的：回顾分析实时荧光RT-PCR检测法在新型冠状病毒核酸检测中的效果。方法：对辖区内276例疑似新型冠状病毒感染者的采集样本以及检测结果进行回溯性分析，所有纳入研究的案例样本均使用实时荧光RT-PCR检测法进行检验，对比分析检测结果。结果：在确诊案例的三种标本采样方式中咽拭子样本的阳性与阴性检出结果数据分别为36（55.38%）、29（44.62%），鼻拭子样本的阳性与阴性检出结果数据分别为41（60.29%）、27（39.71%），痰液样本的阳性与阴性检出结果数据分别为40（56.34%）、31（43.66%）;在无症状确诊患者中阳性与阴性检测结果数据分别为11（31.43%）、24（68.57%），在轻症确诊患者中阳性与阴性检测结果数据分别为28（57.14%）、21（42.86%），在重症确诊患者中阳性与阴性检测结果数据分别为58（62.37%）、35（37.63%），在极重症确诊患者中阳性与阴性检测结果数据分别为17（62.96%）、10（37.04%）（P<0.05）。結论：荧光RT-PCR检测法对新型冠状病毒的检测速率较高，适合临床大范围多人口检测。

关键词：实时荧光RT-PCR;检测方法;新型冠状病毒;核酸结果分析

【中图分类号】 R511 【文献标识码】 A      【文章编号】2107-2306（2022）09--01

前言

新型冠状病毒是于2019年12月开始在全世界范围内出现大基数传播且危害性较高的传染病毒，临床以呼吸道感染、肺炎形式作为病症表现，在检测方式上由于受检范围以及受检人口基数数量较多，需要检测效率较高的方式进行临床检测，此次调研以目前应用较为普遍的荧光RT-PCR检测法作为主体，希望了解其在新型冠状病毒检测中的应用效果。

1. 资料与方法

1.1临床资料

从国家疾病防控信息系统中选取辖区内所有采集的疑似新型冠状病毒感染者276例作为研究主体进行回溯性分析，所有纳入案例均为2019年12月至2021年12月期间采集标本案例，在284例受检者的采样方式中，有咽拭子采样检查者92例，鼻拭子采样检查者92例以及痰液采样检查者92例，受采集者中共有男性141例，女性135例，所有受检者中最少采样1次，最多采样13次，其中伴有发热、咳嗽、流涕等症状者182例，无明显症状者94例，年龄范围中最低龄患者21岁，最高龄患者63岁，平均年龄为（46.26±14.18）岁，所有受检者受检时新冠疫苗接种情况中，未接种者59例，接种1针者105例，接种2针者78例，接种3针者34例;已使用数据分析软件对所有受检者已知前置资料进行比对分析，确定组间差异无统计学意义（P>0.05）。

纳入标准：由医院临床或疾病防控中心收录入管控记录系统的受检案例，可持续追踪且具有持续追踪记录的案例，确诊者具有详细治疗以及跟随检查记录的案例。

排除标准：信息收录不完整的案例，信息收录有误或有疑问的案例，既往新型冠状病毒感染史者，病史不明、家族病史情况不明的案例。

1.2方法

所有受检者标本均使用实时荧光定量RT-PCR进行检测实验，标本采集人员均在接受三级防护情况下按采集标准流程进行鼻腔、咽喉以及痰液体液采集，放入密封袋后分批次集中交由转运者，标本接收以及转运者均于采取二级防护下恒温稳定转运进入传染病检验实验室，检验者对所有采集标本外装密封袋进行75%乙醇喷洒与擦拭消毒以及信息核对后确认接受并进行预处理，预处理过程中将所有采集标本进行灭活，置入提前56°C预热的水浴箱中30-45min，每10min轻微振荡标本，灭活后打开密封袋再次进行试管表面消毒，根据检验计划与待检标本数量进行分类处理，将不能立即检验的标本放置于4°C环境下进行保存，标本最长待检时间不超过24h;将鼻、咽拭子以及痰液标本取出加入1-2mL生理盐水充分振荡混匀后静置10min，加入100μL蛋白酶K，再次充分振荡静置10min，取上清液200μL加入核酸提取试剂预装板中静置10min后放置在核酸提取仪上进行核酸提取，仪器程序运转完成后将核酸置于离心管中，可立即进行进行荧光定量RT-PCR检测的样本可临时存放于-20°C环境中，需要分批次进行检测的样本需要置于-70°C环境中进行保存;荧光定量RT-PCR检测使用新冠病毒核酸检验试剂进行PCR扩增，低温保存样本需要先行室温解冻，融解混匀后再行扩增，17（PCR反应液）：3（Taq酶）配比反应液20μL每份分装至反应管中，并将样本置入进行检测，设置扩增程序15min-50°C、15min-95°C，15s-94°C、45s-55°C，循环45个，最终结果判定标准CT值>40同时Cy5可见扩增、FAM以及VIC无扩增为阴性，CT值≤40同时可见明显扩增为阳性，单一通道CT≤40者需要复检，复检结果相同者为阳性[1-2]。

1.3观察指标

对比确诊案例中不同采集方式下的阳性率情况，对比确诊案例中不同症状程度患者的阳性检出率。

1.4统计学分析

整体使用SPSS 28.0数据分析软件进行数据统计整合与分析处理，%作为数据统计形式时x2进行后续检验，当P<0.05表示对比项目有统计学意义。

2. 结果

2.1在所有确诊案例中咽拭子样本阳性率55.38%，鼻拭子阳性率60.29%，痰液样本阳性率56.34%，组间差异有统计学意义（P<0.05），具体见表1。

2.2在不同症状程度确诊患者的阳性检出率中可见症状表现越严重者阳性检出率越高，组间差异有效（P<0.05），具体见表2。

3.讨论

通过对辖区内既往检测案例结果的回溯性分析中发现实时荧光RT-PCR检测法在新型冠状病毒核酸检测的鼻拭子采集样本阳性检出率以及重症、极重症患者的阳性检出率更高;在临床中新型冠状病毒采集方式主要包括鼻拭子、咽拭子、痰液、粪便等，此次调研以应用频率最高的鼻拭子、咽拭子以及痰液作为研究区分项，通过比对发现痰液以及咽拭子阳性检出率低于鼻拭子的原因在于咽拭子与痰液所采集的干扰物较多，在痰液中唾液以及其他相关粘液组织较多，在检测时可能出现均质化效果较差或需要反复采样重复检测的情况，临床检验效率较低，而咽拭子的采样常由于受检者对检测知识了解程度较低，常出现采集前进食、饮水甚至饮酒的情况，对于采样标本有效率具有严重影响，所以鼻拭子在三种采集方式中的样本质量较高;在症状程度中，多数情况下临床中症状表现程度越严重的患者意味着体内存活病毒数量越多，所以其阳性检出率越高[3]。

整体情况中可见荧光RT-PCR检测法对于新型冠状病毒的检出率并不十分令人满意，但由于其实时检测性质以及检测效率对于这类流行传染病的传播范围以及传播效率的检测实施更为高效，所以在临床中的大范围普查仍建议采用荧光RT-PCR检测法进行检测。

参考文献：

[1]卢婷，陈雨欣，沈瀚.4例COVID-19患者不同类型标本的SARS-CoV-2核酸及抗体检测结果分析[J].临床检验杂志，2020，38（6）：2.

[2]查毅，蒋玲玉，简玲，等.实时荧光定量RT-PCR对新型冠状病毒3种不同生物学样本检出率的比较[J].中华临床实验室管理电子杂志，2021，9（1）：5.

[3]Brunelle S L，Bird P M，Jeremy B，et al.Comparison of the Modified Centers for Disease Control and Prevention 2019-Novel Coronavirus Real-Time RT-PCR Method for Detection of Infectious and Heat-Inactivated Virus on Stainless Steel[J].Journal of AOAC International，2021（4）：4.