不同抗凝剂对富血小板血浆的浓缩及功能的影响

祖文轩,李 林,石 傲,叶子悦,燕博民,蒋邦红,张 莉*

(1蚌埠医学院解剖教研室,蚌埠 233030;2蚌埠医学院第一附属医院整形外科;*通讯作者,E-mail:drzhangli65@163.com)

富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)系全血经离心、分离后浓缩而来的血液制品,自1998年提出以来,已经广泛应用于临床[1]。其内血小板经激活后可释放多种生长因子,例如血小板衍生因子(PDGF)、血管生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF-β)等,在组织创伤局部建立有助于修复的微环境,现已广泛应用于皮肤、肌肉、骨骼等组织创伤的修复[2,3]。目前PRP的制备方法有多种,主要有手工离心分离法、PRP专用提取套盒、成分血单采制备等[4-6]。各种方法的制备过程中,对于全血的收集需要添加抗凝剂,目前广泛应用的抗凝剂为柠檬酸钠。但笔者发现EDTA抗凝管收集并浓缩到的PRP中含有更多血小板数量,对于这一步骤尚缺乏全国统一标准。本文采用3.8%柠檬酸钠抗凝管、EDTA抗凝管和肝素抗凝管分别提取收集PRP,检测血小板数量、形态及激活前后细胞因子的含量等,旨在探索抗凝剂对PRP浓缩及功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验对象

募集健康成年志愿者5名,年龄25～40岁,男3名,女2名。排除心脏病、糖尿病、高血压及高血脂、血液相关疾病等,近期有感染、创伤等疾病。志愿者均签署知情同意书。本研究经蚌埠医学院第一附属医院伦理委员会批准,批准号为2020KY045。

1.2 抗凝剂管

实验按采血抗凝剂的种类进行分组,共分为3组。实验组(EDTA组):EDTA紫头负压采血抗凝管,规格7 ml;阳性对照组(9NC组):3.8%柠檬酸钠蓝头负压采血抗凝管,全血:柠檬酸为9 ∶1,规格10 ml;阴性对照组(肝素组):肝素绿头负压采血抗凝管,规格5 ml。

1.3 血样采集

采取志愿者上肢静脉血,每种抗凝管采20 ml全血,每位志愿者总采血量为60 ml。

1.4 PRP的制备

将不同采血管放置离心机行第一次离心(300g,15 min)。之后取上层血浆及中间血小板层行二次离心(600g,15 min),将中间的血小板层吸出并按1/10全血体积浓缩各组血小板,即每种采血管可最终获得2 ml PRP。取1 ml作血液涂片染色,血常规检测及细菌培养实验。余下1 ml用血浆5倍稀释,留取部分原液,剩余量添加10%葡萄糖酸钙注射液激活,激活前后进行细胞因子浓度检测。

1.5 细菌培养实验

将各组样本送至蚌医一附院检验科微生物实验室,作一般细菌培养+药敏实验。采用血平板接种法,于CO2培养箱内培养3 d,观察有无菌落生长并分离鉴定。

1.6 PDGF和TGF-β的测定

各组样本采用免疫酶联吸附测定试剂盒检测激活前后PDGF和TGF-β的浓度。

1.7 统计学分析

应用GraphPad Prism软件分析数据,对血常规及细胞因子浓度的数据结果行统计学分析,两组间的比较采用独立样本t检验,多组间的比较采用单因素单方差分析。

2 结果

2.1 三组PRP中血常规检测结果

第一次离心后,阴性对照(肝素)组抗凝管中上层血清较为清亮(见图1A),剩余两组较为浑浊。第二次离心后可以明显观察到EDTA组中间压缩的血小板层最厚(见图1B)。此外实验室检查结果提示,三组抗凝剂制备的PRP中血小板计数(PLT)量分别为(1 250.2±246.0)×109/L、(1 030.8±101.7)×109/L、(957.2±89.9)×109/L,其中EDTA组数量最多,阴性对照组数量最少。全血中的PLT数量为(221.0±18.4)×109/L,三组的血小板计数均达到全血中数量的4倍以上,差异有统计学意义(见图2)。血小板平均体积(MPV)和大型血小板比例(P-LCR)在EDTA组和阴性对照(肝素)组中较全血有所升高,而阳性对照(9NC)组与全血没明显差异(见图2)。血小板压积(PCT)与PLT的检测结果相一致,均为EDTA组最高,且组间差异有统计学意义(见图2)。三组中血小板平均分布宽度(PDW)与全血保持一致,差异没有统计学意义(见图2)。

A.第一次离心后3种抗凝剂管内血液分层情况;B.第二次离心后3种抗凝剂管内浓缩血小板层的厚度;紫色圆点代表紫头采血管,即EDTA管;蓝色圆点代表蓝头采血管,即9 NC管;绿色圆点代表绿头采血管,即肝素管图1 三种抗凝剂管在两步离心后得到的血液分层结果Figure 1 Blood stratification in the three anticoagulant tubes after two centrifugation steps

PLT:血小板计数;MPV:血小板平均体积;PCT:血小板压积;P-LCR:大型血小板比例;PDW:血小板平均分布宽度;与全血相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001图2 三种抗凝剂管制备的PRP与全血血常规中血小板相关结果的对比Figure 2 Comparison of platelet-related items between PRP prepared in the three anticoagulant tubes and the whole blood routine

2.2 镜下观察三组PRP的形态特点

三组PRP镜下形态均为不规则的细胞质小块,呈雪花状,在血小板中有细小的紫蓝色颗粒,呈聚集性分布;低倍镜下见EDTA抗凝剂组血小板数量较其余两组更密集,高倍镜下均未发现异常形态的血小板;但阴性对照组中中性粒细胞边缘毛躁(见图3)。

2.3 三组PRP细菌培养结果

细菌培养3 d后,三组所得PRP种植的血平板表面清洁,未见任何菌落生长(见图4)。提示本实验分离浓缩的PRP基本没有细菌污染。

2.4 激活前后细胞因子释放的浓度

钙剂激活可以将PRP中的细胞因子表达量升高。对三组激活前后数据采用配对样本t检验,每组激活后的浓度较激活前都明显升高,差异有统计学意义。此外,采用单因素方差分析得到,不同抗凝剂对激活前和激活后细胞因子的释放均有影响,组间差异有统计学意义。其中,激活前后EDTA组PRP所释放的两种细胞因子的浓度都是三组中最高,且三组间两两比较差异均有统计学意义(见表1)。

黄色箭头所指为血小板,黑色箭头所指为边缘毛躁的白细胞图3 三种抗凝剂管制备的PRP血涂片染色镜下结果Figure 3 Morphology of the PRP prepared in the three anticoagulant tubes by blood smear staining

图4 三种抗凝剂管制备的PRP细菌培养3 d均未检测出细菌Figure 4 No bacteria are detected in the PRP prepared in three anticoagulant tubes after bacterial culture for three days

表1 ELISA检测激活前后PDGF和TGF-β的释放浓度

3 讨论

自体富血小板血浆(PRP)是血小板浓度高于全血的自体外周血经离心、分离、浓缩处理后的液体部分。PRP疗法用于各种适应证已经超过30年,在再生医学治疗中发挥了重要辅助作用。PRP的制备采用自体静脉血,避免了免疫排斥反应,在组织修复过程中得以更好地改善局部微环境,促进难治性创面的愈合[7]。然而不同的患者在注射PRP后预后不尽相同,可能是市面上不同的PRP套装和PRP类系统造成血小板富集度的可变性增大[8]。目前PRP制备方面缺少标准统一的方法,血小板浓缩的倍数也因人而异。

PRP试剂盒因其高昂的成本难以普及,手工离心法制备富血小板血浆有着便捷、易操作、低成本等优点,并且手工离心分离法制备和试剂盒提取在PLT和WBC数量上没有显著的差异[9],但有研究显示不同的离心力和离心时间对PRP质量影响较大[10,11],不同人体、不同部位的血液制备的PRP也存在差别[12,13],PRP中多种细胞因子直接影响其组织修复的能力,PLT浓度越高其相应激活后释放的细胞因子浓度就越高,血小板活化剂氯化钙的浓度作用时间等可能对细胞因子释放产生影响[14]。而这些因素都相同的前提下,是否还有一些操作环节可能对PRP的提取效果产生影响?笔者采用EDTA抗凝管收集全血,二期离心后发现这种抗凝剂管相较柠檬酸钠抗凝剂管可以浓缩到更多的血小板。而目前临床采用的主要是柠檬酸钠制剂的抗凝剂,对于是否可以选用EDTA抗凝剂管浓缩PRP还没有统一的标准[15,16]。

EDTA-2K是国际血液标准化委员会(ICSH)推荐使用的抗凝剂,抗凝的浓度为1.5～2.2 mg/ml全血。它是强有效的金属螯合剂,此抗凝剂不影响白细胞的计数及大小,并且有比柠檬酸钠更强的金属离子结合能力,故可以更好地抑制血小板的聚集,广泛地应用于血常规及凝血实验的全血收集。但是血制品的保存最常使用的抗凝剂为柠檬酸钠制剂,需要降低大量输血后因为金属离子的结合而产生的低血钙,相较于EDTA更为安全。但PRP的提取仅需要50～80 ml的全血,浓缩以后的PRP中抗凝剂的含量并不会在局部注射后明显影响体内的离子浓度。

本实验选用了三组抗凝剂对PRP提取的效果进行对比,采取了相同的制备方法,规避了其他因素对PRP质量的影响,实验室检查结果提示EDTA管提取PLT数量高达(1 250.2±246.0)×109/L,优于3.8%柠檬酸钠抗凝管和肝素抗凝管,平均可达到全血的5～6倍,而肝素管仅3～4倍。需要注意的是,EDTA可以使血小板平均体积升高至11.4～12.9,以及大型血小板比例(P-LCR)平均升高至40.76%,但这一变化并没有达到异常状态,镜下的观察亦没有发现异常形态和分布的血小板。此外,为了验证三组PRP的生物学作用,本实验采用ELISA检测钙剂激活前后PRP中释放的PDGF和TGF-β1的浓度。PDGF和TGF-β1为PRP释放的众多生物因子中作用最广泛,最有利于促进创面愈合的两种因子之一。结果提示,EDTA抗凝管提取的PRP中释放的两种因子较其他两组总体都相应偏高,在创面愈合等疾病的治疗中可以发挥更有利的生物学作用。作为可以加强凝血酶以及灭活多种凝血因子的临床常用抗凝剂,肝素与EDTA和柠檬酸钠的抗凝原理完全不同,故在第一次离心后,上清液十分清澈,血小板亦因压合牢固难以取出。本课题采用肝素作为阴性对照,其对PRP的浓缩效果并不理想,不推荐使用。

PRP可促进慢性难愈合的创面以及骨缺损和软骨的再生,得益于其内多种细胞因子的释放和其独特的抗菌性[17-20],如何在制备的过程中保证PRP的质量及浓度需要进一步探索和研究。本实验应用相关方法验证得到,EDTA抗凝剂采血收集全血,二次梯度离心后,得到的PRP中血小板数量更多,且钙剂激活后,PDGF和TGF-β1两种因子的释放浓度也相应提高,未来还需对血小板的功能做进一步的测定和分析,对是否可以采用EDTA抗凝剂制备PRP提供更进一步的实验基础。