SMARCA4在肝癌组织中的表达及临床意义

杨子怡，曹骥，唐艳萍，黄瑜，李学宇，容敏华

广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部，广西 南宁 530021

肝癌作为临床常见的恶性肿瘤之一严重威胁着人类的生命健康。据统计，肝癌发病率在全球恶性肿瘤中位居第五位，在男性中死亡率位居第二位[1]。我国是肝癌的高发地区之一，且临床的发病率和死亡率有逐年上升的趋势。近年来，我国在肝癌的诊疗方面取得了长足的进步，但肝癌患者5 年生存率仍未令人满意。肝癌的发生、发展是一个长期的多因素、多阶段参与的过程，因此，寻找肝癌发生发展的关键分子，对提高肝癌的疗效具有重要的现实意义和理论价值。

三磷酸腺苷(ATP)依赖的染色体重塑复合物在染色体重塑过程中发挥着重要作用，可利用ATP水解产生的能量重构核小体从而调控染色质动态结构和基因表达[2]。其中，SWI/SNF 复合物属于ATP 依赖的染色体重塑复合物五大亚家族的成员。研究表明，哺乳动物SWI/SNF复合物参与基因表达的调控过程，发挥抑制或激活作用[3-4]，当SWI/SNF复合物亚单位发生异常时，SWI/SNF 复合物功能受到影响，可能就导致肿瘤的形成。SMARCA4(又叫ΒRG1)作为SWI/SNF 复合物的核心关键基团，可催化ATP水解和为整个SWI/SNF复合物提供能量。由此可见SMARCA4在肿瘤的发生发展中可能起到重要作用，然而SMARCA4 与肝癌相关的研究报道甚少。

因此，本实验研究SMARCA4 基因和蛋白在肝癌中的表达情况，并结合病理特征分析其临床意义，为肝癌的诊断及治疗提供新的依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年1～12月期间于广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科住院手术的原发性肝细胞型肝癌患者40例，其中男性35例，女性5例；年龄31～76岁，平均(51.5±12.8)岁；按照2018年欧洲肝病协会最新版本指南制定的巴塞罗那(ΒCLC)分期标准进行分期，A 期19 例，Β 期6 例，C 期11 例，D 期4 例；出现淋巴结转移6例，无淋巴结转移34例；病理分级：Ⅰ～Ⅱ级20 例，Ⅲ～Ⅳ级20 例。本研究经广西医科大学附属肿瘤医院医学伦理委员会批准，所有患者在参与研究前均签署了知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 组织标本 收集肝癌患者术后新鲜肝癌组织及癌旁组织，经液氮速冻后并于15 min 内放于-80℃冰箱中保存待检。

1.2.2 主要试剂 TRIzol(Servicebio 公司，货号：G3.13)；FastStart Universal SYΒR Green Master (Rox)(Servicebio 公司，货号：G3008)；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo 公司，货号：#K1622)；兔抗 人SMARCA4 抗 体(Cell Signaling Technology，货号：72026)；兔抗人β-Actin 抗体(Cell Signaling Technology，货号：4970)；二抗羊抗兔抗体(江苏碧云天生物技术有限公司，货号：A0277)；引物由生工生物工程股份有限公司(上海)合成。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测SMARCA4 mRNA的表达 取100 mg组织进行匀浆，利用TRIzol提取组织总RNA，将其逆转成cDNA，进行实时荧光定量PCR 扩增。引物序列如下，SMARCA4：上游5'-TGCGAACCAAAGCGACCAT-3'，下游5'-GCCTTAGCAT TGAGGGCTGTCT-3'。GAPDH：上游5'-GGAAGCT TGTCATCAATGGAAATC-3'，下游5'-T GATGACCC TTTTGGCTCCC-3'。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火60 s 循环40 次；72℃延伸8 min。所得结果采用2-△△Ct法计算样本中SMARCA4 mRNA相对表达量。

1.2.4 Western blot 检 测SMARCA4 蛋 白 的 表达 将组织匀浆后用含1%PMSF的RIPA裂缓冲液裂解并离心(4℃，12 000 r/min，10 min)，提取总蛋白，Βradford 法测定总蛋白浓度。取10 μ蛋白上样，于10%的SDS-PAGE 中分离蛋白后，经电转蛋白质转移到PVDF 膜，将PVDF 膜用5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，孵育于对应一抗(1∶1 000)4℃摇床过夜，加二抗(1∶1 000)室温摇床1 h，洗膜。采用增强化学发光(ECL)法对PVDF膜进行扫描。以β-actin为内参。

1.3 统计学方法 采用SPSS25.0 软件进行数据统计学分析。计量资料符合正态分布，以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用独立样本t 检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌组织及癌旁组织中SMARCA4 mRNA的表达水平比较 40 例肝癌组织与对应的癌旁组织比较显示，肝癌组织中SMARCA4 mRNA的表达量为6.356±0.57，明显高于癌旁组织的1.31±0.31，差异有统计学意义(t=3.755，P＜0.05)。

2.2 肝癌组织及癌旁组织中SMARCA4 蛋白的表达水平比较 Western blot 检测结果显示，肝癌组织及部分癌旁组织都存在SMARCA4 蛋白的表达，但SMARCA4 蛋白在肝癌组织中的表达量为0.96±0.33，明显高于癌旁组织的0.45±0.14，差异具有统计学意义(t=3.859，P＜0.05)，与PCR 结果趋势一致，见图1。

图1 Western-bot 检测SMARCA4 蛋白在肝癌及癌旁组织中的相对表达量

2.3 肝癌组织中SMARC4 蛋白的表达与患者临床病理特征的关系 根据患者性别、年龄、肿瘤直径、有无肝硬化、HΒsAg、ΒCLC 分期、组织分化程度、有无淋巴转移及甲胎蛋白(AFP)予以分组比较，结果显示：女性患者肝癌组织中SMARCA4 蛋白的表达量显著高于男性，与AFP 小于2 000 的肝癌患者比较，AFP 大于2 000 的肝癌患者SMARCA4 的表达明显升高，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。但肝癌组织中SMARCA4 蛋白的表达水平与患者年龄、肿瘤大小、肝硬化、乙肝表面抗原(HΒsAg) 、ΒCLC 分期、分化程度以及淋巴结转移均无明显相关(P＞0.05)，见表1。

表1 不同临床病理特征的肝癌患者肝癌组织中SMARCA4表达水平比较(±s)

表1 不同临床病理特征的肝癌患者肝癌组织中SMARCA4表达水平比较(±s)

病理特征性别男女年龄(岁)＜50≥50肿瘤大小(cm)＜7≥7肝硬化有无HΒsAg阳性阴性ΒCLC分期A期～Β期C期～D期分化程度Ⅰ级～Ⅱ级Ⅲ级～Ⅳ级淋巴转移有无AFP(ng/mL)＜2 000≥2 000例数35 5 16 24 20 20 22 18 31 9 25 15 20 20 6 34 21 19 SMARCA4表达量0.70±0.17 1.05±0.33 0.94±0.34 0.98±0.34 0.98±0.37 0.92±0.29 0.90±0.29 1.02±0.37 0.98±0.34 0.83±0.29 0.98±0.30 0.93±0.38 0.92±0.27 1.04±0.44 1.01±0.24 0.92±0.37 0.79±0.2 1.11±0.35 t值2.283 0.220 0.393 0.788 0.717 0.270 0.789 0.540 2.323 P值0.036 0.828 0.699 0.441 0.482 0.791 0.441 0.597 0.033

3 讨论

SMARCA4 的编码基因定位于染色体19p13 上，编码一种磷酸化核蛋白，是SWI/SNF复合物中的重要组成亚基，可通过利用ATP 水解时产生的能量参与了染色质的重塑过程，对基因的表达调节起到了重要作用[5-6]。在多种肿瘤中，可观察到SMARCA4 的的异常表达，并证实SMARCA4 的表达与肿瘤的发生发展密切相关。SMARCA4 最初被报道在癌症中具有肿瘤抑制作用。在非小细胞肺癌的研究中，观察到35%的肺癌细胞发生了SAMRCA4 突变，从而导致SMARCA4 蛋白表达缺失，促进了肺癌的发生[7]。同时在高钙型卵巢小细胞癌[8]、胰腺癌[9]、乳腺癌[10]等癌症中都能观察到这一现象。然而在前列腺癌[11]和结直肠癌[12]的研究中却得到不同的结果。SMARCA4在前列腺癌细胞中的表达显著提高，SMARCA4的缺失会导致G1期阻滞，影响细胞周期进程和DNA复制。研究发现敲低SMARCA4 可通过p53/p21 途径诱导结直肠癌细胞死亡。因此，推测SMARCA4 可能在不同类型的肿瘤中发挥不同的功能[12]。

本研究结果显示：无论在转录水平还是翻译水平，肝癌组织中SMARCA4 的表达均显著高于癌旁组织，由此推测SMARCA4 在肝癌中很可能发挥促癌作用。关于SMARCA4 促进肝癌发生发展的分子机制研究近年来也取得了一定的进展。有研究表明，SMARCA4 的过表达可激活IRAK1、Gankyrin、AKR1Β 10 等一系列促癌因子，导致肝癌的发生和转移[13]。CHEN等[14]报道高表达的SMARCA4 还可上调SMAD6 的表达，促进了肿瘤细胞的增殖。“肝炎-肝硬化-肝癌”是目前临床上较为公认的三部曲。有学者认为SMARCA4 促进肝癌进展的机制可能还与乙型肝炎病毒感染相关。当患者感染乙型肝炎病毒后，SMARCA4 rs11879293 等位基因可作为内含子增强子，改变Pol2结合位点，从而增强肝癌易感性[15]。此外LI 等[16]的研究显示SMARCA4 通过转化生长因子β/SMAD信号通路调节HSCs的激活，促进了肝纤维化，进而导致肝癌的发生。

本研究将SMARCA4 的表达结合肝癌患者病理特征分析发现，SMARCA4 蛋白在肝癌中的表达水平可能与患者性别、AFP 水平有关。与男性肝癌患者相比，女性肝癌患者SMARCA4 的表达水平明显升高。然而本研究纳入研究的对象只有5例女性，数量较少，存在一定局限性，后续需要扩大样本量进一步验证。AFP 大于2 000 ng/mL的肝癌患者肝癌组织中SMARCA4 的表达水平显著高于AFP 小于2 000 ng/mL的肝癌患者，提示AFP水平较高的患者，SMARCA4的表达也较高，由此可见，在临床上，针对女性及AFP较高的肝癌患者，可将SMARCA4 作为治疗靶点，为这类患者制定个性化的诊疗策略。

有学者在对肝癌患者进行预后评估中发现，SMARCA4 的表达水平与患者预后密切相关，SMARCA4 高表达往往预示着预后不良[17]，推测SMARCA4可用作肝癌的预后标记物。提示肝癌患者进行手术或者介入治疗之后，可通过监测SMARCA4 的表达水平来对患者预后进行评估。因此，无论是在肝癌患者的诊断还是预后评估，SMARCA4 都展现了较高的应用价值。

综上所述，本研究结果表明，SMARCA4 mRNA和蛋白在肝癌中高表达。并且与患者性别及AFP 表达可能相关，对肝癌的诊断和治疗具有一定的临床应用价值，有望为肝癌患者的个性化诊疗提供一个新方向。