益气散聚方对肥胖相关肾小球病模型小鼠AMPK信号通路的影响及机制研究

方明珠，徐艳秋，顾耀东

1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院肾内科，上海 200437；

2.上海市第六人民医院金山分院中医内科，上海 201599

肥胖相关性肾病多以肥胖为主诱因，机体代谢发生紊乱继而引发的肾病。其特点为起病隐匿、临床特征不明显、大多患者就诊时已有显性蛋白尿现象。AMPK 存在于人类肾脏组织中，并广泛表达，是调控细胞能量代谢关键步骤[1-2]。当抑制AMPK 活性时则会激活肾脏代谢均衡失常性氧化应激反应，此时炎症反应系统同时启动，引起肾脏一系列病理特征变化，包括肾脏组织中系膜基质积聚、足细胞肥大、系膜扩张等[3-4]。研究发现，AMPK信号通路异常既是肥胖相关性肾病直接致病因素又是其肾脏并发症的重要病理基础。改善AMPK信号通路，对原发病进程阻断与并发症预防有重要意义，然而，目前市场上并无相关疗效突出的化学药品。王文健教授基于“聚证理论”创立了益气散聚方，是治疗肥胖相关性肾病的基本方，临床加减应用在治疗中效果显著，减少肥胖发生，抑制炎症反应，改善肾脏功能[5-7]。本研究通过观察益气散聚方对肥胖相关性肾病模型小鼠AMPK 信号通路的影响，探讨AMPK诱发炎症反应的具体机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 挑选60 只雄性C57ΒL/6 小鼠，均为6 周龄，每只小鼠体质量相差不大，均约18 g，由北京海淀区实验动物中心购买，现于我院动物实验中心饲养。

1.2 主要药品及试剂 益气散聚方浓缩颗粒剂：黄芪、黄连、蒲黄、泽泻、茵陈，天江药业提供(1 包与原生药材黄连3 g、黄芪12 g、茵陈7.5 g、泽泻5 g、蒲黄7.5 g的剂量等同)。石蜡切片糖原染色试剂盒(汉恒科技公司)；Trizol(昆山金城试剂公司)；cDNA 合成试剂盒、荧光定量PCR试剂盒®(赛默飞中国公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制作 将所有C57ΒL/6 雄性小鼠进行为期1 周的适应性饲养后，随机分为模型组54 只与正常组6只。造模参考文献[8]，为通过喂养高脂饲料而诱导肥胖的模型。所有小鼠进食、饮水均不受限制，所处室温在15℃～25℃，湿度(65%±5%)，交替照明周期为12 h。饲料的配方如下：猪油20%、胆固醇2%、食用盐5%、胆盐0.5%、脱脂奶粉10%、白砂糖10%、普通饲料53.5%，委托方为北京实验动物中心。

1.3.2 实验分组 根据随机原则对成功造模的54 只小鼠分四组，包括模型组、中药组、西药组、中西医结合组，数量分配中药组18 只，其余三组每组各分配12只。

1.3.3 药物干预 用药时间选择于造模4周后，喂养剂量：约为成人剂量的20倍灌服药物，0.5 mL/(次·d)(具体参考人鼠剂量换算)。正常组：生理盐水。模型组：生理盐水。中药组：益气散聚方(益气散聚方颗粒，浓度为1.5 g/mL)。西药组：灌服盐酸二甲双胍配成浓度为0.25 g/mL 混悬液(0.5 g/片中美施贵宝制药，批号：11120165)。中西医结合组：灌服益气散聚方+盐酸二甲双胍。

1.4 标本采集与检测

1.4.1 标本获取 饲养动物摄水、食自由，天平称取体质量，尾静脉测血糖，并置小鼠于代谢笼观察24 h，不予喂食，但饮水自由，对其尿液进行留取，1 d后将小鼠尿液收集起来进行离心5 min处理，3 000 r/min转速分离上清，冷冻保存。实验进行第4周末时，依次取不同组别提前标记1～6 号的小鼠归笼集合并于腹腔内注射4%水合氯醛0.2 mL/20 g，成功麻醉小鼠进行手术准备，沿腹白线使用手术剪将其腹腔逐层打开，取其两侧肾脏并称重，取左肾下极1/3肾组织，置于配比好浓度福尔马林固定液内备用，行HE染色，镜下观察所取组织病理改变，取右肾及左肾上级2/3 放入离心管，管中提前滴入1.5 mL生理盐水中，低温-73℃存放，基因蛋白检测时备用。实验进行至8 周末时，取所有剩余小鼠行麻醉取肾脏，方法同上。

1.4.2 一般项目检测 血糖：禁食1 d 后剪取小鼠尾血，应用血糖仪对小鼠血糖进行测定。体质量：每14 d 通过电子计重器对小鼠的体质量进行称取并记录。尿NAG、尿RΒP、尿MA、24 h尿蛋白定量：全制动生化仪化学发光法检测。

1.4.3 肾脏组织HE 染色 使用Motic Images Advanced 3.2医学图像分析系统对其进行统计。每片测量20个肾小球的肾小球直径，计算均值后记为最终结果。免疫组化半定量法检验p-AMPKα蛋白含量。Motic Med 6.0 软件分析结果，具体分析方法为“点计数法”，每个样本为完整且不重复的20个肾小球，计数测试系统用点密度代表结果，即阳性面积比/总肾小球襻面积比，计算均值后记为最终结果。通过实时定量PCR 对转化生长因子β1(TGF-β1)、单核细胞趋化因子(MCP-1)、磷酸化腺苷酸激活蛋白激酶α (PAMPK-α mRNA)的表达进行测定。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0和Graphpad 8.0统计软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，符合正态分布的计量资料采用独立样本t检验，不符合正态分布采用Wilcoxon检验，计数资料以频数表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物干预第4周末和第8周末各组小鼠体质量比较 正常组、模型组、西药组、中药组的小鼠在用药的第4 周末和第8 周末所测得的体质量均增加，而中西医结合组小鼠的体质量较中药组、西药组、模型组下降，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 各组小鼠用药后体质量动态变化(±s，g)

表1 各组小鼠用药后体质量动态变化(±s，g)

注：与同时间点模型组比较，aP＜0.05；与同时间点中药组比较，bP＜0.05；与同时间点西药组比较，cP＜0.05。

组别正常组模型组西药组中药组中西医结合组只数6 12 12 18 12第4周末27.80±0.53 28.93±1.37 29.02±1.57 29.83±1.28 29.38±1.77第8周末30.57±2.11 32.62±2.45 31.93±2.81 32.26±2.20 27.83±5.55abc t值3.118 3.219 2.214 2.864 2.651 P值0.011 0.009 0.041 0.011 0.029体质量

2.2 药物干预第4周末和第8周末各组小鼠血糖比较 药物治疗第4 周末，各组小鼠测的血糖均有升高，但差异无统计学意义(P＞0.05)；比较正常组与模型组小鼠血糖，发现后者较前者有所升高，但差异无统计学意义(P＞0.05)；药物治疗第8 周末，比较模型组与中西医结合组、中药组小鼠血糖，发现中西医结合组、中药组小鼠的血糖较模型组有所降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2 各组小鼠干预后的血糖动态变化(±s，mmol/L)

表2 各组小鼠干预后的血糖动态变化(±s，mmol/L)

组别正常组模型组西药组中药组中西医结合组只数6 12 12 18 12第4周末3.67±2.04 3.32±0.60 3.58±0.44 3.23±1.20 3.73±1.78第8周末2.97±0.47 3.58±0.82 3.82±0.55 3.14±0.80 3.03±0.90 t值0.819 0.626 0.834 0.187 0.859 P值0.431 0.545 0.423 0.853 0.41血糖

2.3 药物干预第4 周末和第8 周末各组小鼠尿MA比较 模型组小鼠第4周末、第8 周末尿MA较正常组升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；第8 周末中药组、西药组、中西医结合组小鼠尿MA均较模型组降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)，且三组中中西医结合组小鼠尿MA下降最明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3 各组小鼠干预后尿MA动态变化(±s，μg/mL)

表3 各组小鼠干预后尿MA动态变化(±s，μg/mL)

注：与时间点模型组比较，aP＜0.01，bP＜0.05。

组别正常组模型组西药组中药组中西医结合组只数6 12 12 18 12第4周末16.71±0.76b 41.60±3.35 44.42±2.70 45.39±3.21 46.23±2.67第8周末16.59±0.61b 47.65±3.12 41.04±2.02b 39.70±3.04b 23.44±2.40a t值0.301 3.237 2.455 3.852 15.549 P值0.769 0.008 0.034 0.001 0.001尿MA

2.4 药物干预第4 周末和第8 周末各组小鼠尿NAG比较 比较模型组与正常组小鼠在第4周末、第8 周末的尿NAG 值，发现前者高于后者，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)；比较模型组与中药组、中西医结合组、西药组小鼠在第8 周末的尿NAG 值，发现后三组尿NAG值降低，且比模型组下降明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表4。

表4 各组小鼠干预后尿NAG动态变化(±s，U/L)

表4 各组小鼠干预后尿NAG动态变化(±s，U/L)

注：与同时间点模型组比较，aP＜0.01。

组别正常组模型组西药组中药组中西医结合组只数6 12 12 18 12第4周末41.40±15.44a 63.70±9.80 73.05±12.74 73.17±10.92 62.85±13.62第8周末45.30±12.81a 78.82±11.94 35.72±7.09a 37.52±7.78a 36.32±8.87a t值0.476 2.397 6.272 7.977 3.998 P值0.644 0.057 0.001 0.001 0.002尿NAG

2.5 药物干预第4 周末和第8 周末各组小鼠尿RΒP比较 比较模型组与正常组小鼠在第4周末、第8周末的尿RΒP 值，发现前者较后者增长，但差异无统计学意义(P＞0.05)；比较模型组与中药组、中西医结合组、西药组小鼠在第8周末的尿RΒP值，发现后三组尿RΒP 值均降低，且比模型组下降明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表5。

表5 各组小鼠干预后尿RBP动态变化(±s，mg/L)

表5 各组小鼠干预后尿RBP动态变化(±s，mg/L)

注：与同时间点模型组比较，aP＜0.01。

组别正常组模型组西药组中药组中西医结合组只数6 12 12 18 12第4周末1.78±0.28 1.86±0.34 2.03±0.31 2.06±0.42 2.33±0.37第8周末1.93±0.22 2.81±0.26 1.27±0.21a 0.52±0.19a 0.65±0.26a t值0.586 1.497 3.272 6.677 5.798 P值0.714 0.087 0.002 0.001 0.001尿RΒP

2.6 药物干预第4周末和第8周末各组小鼠24 h尿蛋白定量比较 模型组小鼠第4周末、第8周末24 h尿蛋白较正常组升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；中药组、中西医结合组第8 周末24 h 尿蛋白定量下降(P＜0.05)。中西医结合组、中药组比模型组、西药组降低明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表6。

表6 各组小鼠接受1 d干预后尿蛋白的动态变化(±s，mg/L)

表6 各组小鼠接受1 d干预后尿蛋白的动态变化(±s，mg/L)

注：与同时间点模型组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与同时间点西药组比较，cP＜0.01。

组别正常组模型组西药组中药组中西医结合组只数6 12 12 18 12第4周末0.67±0.19a 1.98±0.39 2.07±0.57 2.18±0.61 2.21±0.5737第8周末0.96±0.24a 2.63±0.62 2.44±0.66 1.35±0.31ac 1.62±0.47bc t值1.153 1.091 0.464 2.861 2.173 P值1.153 1.091 0.464 2.861 2.173 24 h尿蛋白定量

2.7 药物干预第4周末和第8周末肾脏病理改变

2.7.1 基本肾脏病理改变 模型组、中药组、西药组、中西医结合组治疗4周后肾小球体积增大，肾小球囊腔变小，固有细胞无增生，系膜区未见明显增生，肾小管间质正常，未见细胞浸润，肾血管未见异常，见图1。

图1 各组小鼠肾脏H&E染色(×200)

2.7.2 肾小球直径变化 模型组小鼠第4 周末、第8 周末肾小球直径较正常组升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；中药组、中西医结合组第8 周末肾小球直径下降，两组较模型组、西药组均降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)。中药组治疗8 周后肾小球直径显著下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表7。

表7 各组小鼠肾小球直径变化(±s，μm)

表7 各组小鼠肾小球直径变化(±s，μm)

注：组内比较，aP＜0.05；与同时间点模型组比较，bP＜0.05。

组别正常组模型组西药组中药组中西医结合组只数6 12 12 18 12第4周末49.78±2.79b 60.05±3.07 56.57±1.81 69.06±3.44 61.83±1.54第8周末48.64±3.06b 64.44±1.65 61.50±1.01 60.27±4.64a 56.97±3.47 t值0.674 3.085 5.826 4.565 3.136 P值0.515 0.011 0.001 0.001 0.011肾小球直径

2.7.3 肾脏组织PAMPK-α的变化 各组小鼠肾脏组织PAMPK-α免疫组化光镜下可见显色后的PAMPK-α呈棕褐色，主要在肾脏组织毛细血管内皮细胞和肾小管上皮细胞表达。模型组第4周末、第8周末肾脏组织PAMPK-α表达较正常组比较明显下降，差异有显著统计学意义(P＜0.01)；中药组、西药组、中西医结合组第8 周末PAMPK-α表达较模型组比较有明显升高，差异有显著统计学意义(P＜0.01)，见表8、图2。

图2 各组小鼠肾脏免疫组化(×200)

表8 各组PAMPK-α阳性面积比较(±s)

表8 各组PAMPK-α阳性面积比较(±s)

注：与模型组比较，aP＜0.01。

组别正常组模型组西药组中药组中西医结合组只数6 12 12 18 12第4周末779.89±100.31a 338.22±25.22 303.00±78.01 379.44±123.61 369.33±119.50第8周末785.89±63.90a 281.33±24.29 452.89±47.15a 482.22±39.45a 497.56±46.58a t值0.123 3.979 4.027 2.376 2.448 P值0.904 0.002 0.002 0.030 0.034 PAMPK-α阳性面积

2.8 药物干预第4 周末和第8 周末各组小鼠的TGF-β1mRNA、MCP-1 mRNA、PAMPK-α mRNA 的表达 模型组小鼠第4周末、第8周末MCP-1 mRNA、TGF-β1mRNA 表达较正常组升高，PAMPK-α mRNA较正常组下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)；第8周末中西医结合组、中药组的TGF-β1、MCP-1 mRNA均下降，且与模型组比较发现中西医结合组、中药组均降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；第8周末西药组的MCP-1 mRNA含量降低，与模型组进行比较，发现西药组较模型组有所下降，但差异无统计学意义(P＞0.05)；第8周末西药组的TGF-β1mRNA含量升高，与模型组进行比较差异具有统计学意义(P＜0.05)；中药组、西药组、中西医结合组的小鼠第8周末PAMPK-α mRNA升高，三组较模型组均升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表9、表10。MCP-1、TGF-β1、PAMPK-α基因PCR扩增动力学曲线见图3～图6。

表9 各组小鼠接受干预后TGF-β1、MCP-1 mRNA的动态变化(±s)

表9 各组小鼠接受干预后TGF-β1、MCP-1 mRNA的动态变化(±s)

注：与同时间点模型组比较，aP＜0.05。

组别正常组模型组西药组中药组中西医结合组只数6 12 12 18 12第4周末0.40±0.13a 1.74±1.04 1.80±0.93 1.03±0.23 0.63±0.10第8周末0.41±0.05a 1.99±1.01 1.64±0.18 0.87±0.48a 0.37±0.45a t值0.175 0.422 0.414 3.698 2.887 P值0.894 0.682 0.688 0.002 0.042 MCP-1第4周末0.29±0.08a 0.53±0.35 0.96±0.36 0.44±0.30 0.62±0.10第8周末0.39±0.11a 0.71±0.66 1.56±0.89a 0.22±0.13a 0.59±0.14a t值1.801 0.59 1.531 2.237 0.427 P值0.102 0.568 0.157 0.047 0.678 TGF-β1

表10 各组小鼠干预后PAMPK-α mRNA动态变化(±s)

表10 各组小鼠干预后PAMPK-α mRNA动态变化(±s)

注：与同时间点模型组比较，aP＜0.05。

组别正常组模型组西药组中药组中西医结合组只数6 12 12 18 12第4周末4.06±0.10a 3.44±0.12 3.55±0.26 3.63±0.19 3.50±0.57第8周末4.09±0.72a 3.42±0.05 4.84±0.24a 4.78±0.36a 4.81±0.51a t值0.101 0.376 8.93 8.475 4.195 P值0.904 0.002 0.002 0.030 0.034 PAMPK-α基因表达

图3 b-actin mRNA基因扩增曲线

图4 TGF-β1 mRNA基因扩增曲线

图5 MCP-1 mRNA基因扩增曲线

图6 p-AMPKa mRNA基因扩增曲线

3 讨论

肥胖患者脂肪堆积脂肪细胞增生肥大并受多元因素影响，多是由于摄能量多而消耗能不足，能量代谢紊乱性慢性代谢性疾病。根据发病机制与病因肥胖可分继发性肥胖、单纯性肥胖两类。单纯性肥胖隶属于生活方式不当而引起的脂肪过度增生的一种慢性疾病，其与运动缺乏、营养不均、行为偏差密切相关，不曾患有内分泌疾病、无其他可诱发肥胖的疾病的单纯性肥胖患者人数超过肥胖总人数的95%。本研究中肥胖相关性肾病是由单纯性肥胖引发，尿液分析可见微量白蛋白尿，大量蛋白尿较为罕见，并可于镜检发现肾小球病理变化包括：肥大、节段性肾小球硬化等。诸多中医肾病学领域专家认为肥胖相关性肾病致病关键因素为“痰、湿、瘀”，病位为脾脏，脾虚为本，痰湿内盛，互结为瘀，其肥胖发生本源为“脾虚化失调，无法升清泌浊，浊气日久停聚体内生痰湿瘀血，谓之为肥胖之本源”。王文健教授认为本病治则为：“益气祛湿，健脾化瘀”，并由此为指导创立了益气散聚方。该方包括黄芪、泽泻、黄连、蒲黄，其中黄芪具有补中益气的作用，为君药；泽泻善于利水且渗湿泄热性强，其性味甘寒，可佐助黄连清热之功；黄连燥湿泻火，性味苦寒，为臣药；蒲黄味甘且性微寒，既入血分……滞者可行，故为佐使。此方共奏益气散聚之功。本实验研究结果提示：予以药物4 周治疗后动物体质量变化方面发现中西医结合组较其他各组降低明显，揭示了益气散聚方可显著改善小鼠肥胖属性。中药组、西药组、中西医结合组小鼠予以给药4 周后24 h 尿蛋白定量，尿液含量中的RΒP、MA、NAG 较模型组减少显著，其中中药组治疗更具有优势，揭示益气散聚方有效改善肥胖导致的肾损害，与之同时可降低蛋白尿。

肥胖的发生部位为脂肪组织，其本质为炎症性疾病，炎症的特点为慢性、低度、持续性。在体内能量代谢不协调时，脂肪细胞、巨噬细胞可分泌多个种类的脂肪细胞相关炎症因子，如TGF-β1、MCP-1 等，肥胖引发的较低水平的炎症反应与此类相关炎症因子密切相关，在与肥胖有关肾病的进程中起到重要的作用，肾小球病变关键因子即TGF-β1，在肾脏组织中广泛存在，也是一种致纤维化因子，于肾脏组织中，对肾脏细胞肥大起促进作用，同时加速系膜细胞外基质的增生速率，而对细胞外基质降解起抑制的作用，从而致使肥胖相关肾病患者的肾小球发生硬化；MCP-1的过表达促使单核细胞和巨噬细胞浸润加速，加速释放了TNF-α、IL-6、TGF-β1等炎症因子，促使肾组织炎性变态反应和组织纤维化程度日趋加重。本研究可知：予以4 周药物治疗后中药组、中西医结合组实验动物中MCP-1 mRNA、TGF-β1mRNA表达呈减少趋势，两组较模型组均降低，说明益气散聚方能够降低炎症因子的表达，改善肥胖相关肾组织炎细胞浸润及纤维化进程。

肥胖相关性肾炎是一种慢性疾病进程。本研究的主题是肥胖和高胰岛素血症引起的肾小管损伤等与其他损害肾功能的常见因素有明显差异。本研究是从炎症因子的表达来讨论肥胖相关性肾炎的病理机理。而AMPK 信号通路活性降低可激活炎症反应进而引发肾损伤。AMPK 通常在肾脏中表达，包括足细胞、系膜细胞、内皮细胞和肾小管损伤的上皮细胞。基于抑制人体炎症、体细胞生长和蛋白质合成的作用，它可以控制肾脏的各种功能及病理状态。本研究的结果表示：治疗1个月后，比较模型组与中西医结合组、西药组、中药组的PAMPK-α表达情况，发现后三组升高明显，其PAMPK-α mRNA含量增加显著，表明益气散聚方通过提高AMPK 在血清和肾脏组织中的表达抑制炎症因子，改善肥胖相关肾小球肥大和肾间质纤维化进程。

肥胖相关肾脏损伤与机体炎症反应密切相关，而在炎症反应介导进程中，AMPK信号转导通路起关键作用。AMPK 可促进合成巨噬细胞进而抑制炎性细胞因子白介素-10、TNF-α的合成，进而抑制脂肪细胞TGF-β1、白介素-10 合成进程[8-10]。AMPK可抑制肾小球内皮细胞核因子κΒ(nuclear factor-κΒ，NF-κΒ)表达来减少MCP-Ⅰ表达[11]。实验室中益气散聚方可活化AMPK，抑制炎症因子TGF-β1、MCP-1、IL-6、TNF-α等的表达，改善肥胖相关肾小球肥大和肾间质纤维化进程。

AMPK 的抑炎机制是通过抑制JNK 激酶而表现出来的[12]。JNK 激酶调控下游转录因子核因子NF-κ Β，加速释放促炎性因子。NF-κΒ 信号发挥主要作用的过程为激活先天免疫与适应性免疫系统肥胖时游离脂肪酸FFA(free fatty acid)通过脂肪细胞表面的Toll 样受体4 介导，启动NF-κΒ炎症信号通路，引发炎症反应。实验室发现AMPK 活化对抑制NF-κΒ 信号表达对抑制炎症因子分泌起重要作用。然而对于肾组织内AMPK 调控炎症因子关系尚未明确，需深入研究。