玉蜀黍尾孢菌VelB 基因敲除及生物信息学分析

路媛媛，孙承龙，谭玉琴，魏文杰，史咸春，宋艳波，李丽，刘振宇

（1.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 园艺学院，山西 太谷 030801；3.山西农业大学 信息科学与工程学院，山西 太谷 030801）

玉米灰斑病是世界玉米种植区重要真菌性病害之一，其病原菌为玉蜀黍尾孢菌（Cecrospora ze⁃ae⁃maydisTehon & Daniels），属子囊菌门球腔菌属真菌［1］。自1991年首次在我国辽宁丹东地区发现该病害以来，玉米灰斑病菌在我国多次爆发流行，近些年在东北地区大面积发生，危害程度达3～5 级，严重地块达7 级，给玉米生产造成了惨重损失［2］。随后在山东、吉林、云南等地区相继发生，成为我国东北和西南玉米产区一种重要病害［3］。

病原菌致病性分化与变异是引起病害流行的主导因素之一。对病原菌进行致病性研究发现，病原菌侵染后显症速度不同，且出现的病斑类型也存在明显差异。通过血清学和蛋白质组学研究证明了病原菌存在分化现象［4］。对玉蜀黍尾孢菌致病性的研究主要集中在尾孢毒素方面。长期以来，致病学家和化学家研究内容主要集中在尾孢毒素的分离、纯化［5］和化学结构鉴定［6］等方面。目前对尾孢毒素的提取仍采用浓缩浸提法［7］，研究发现该毒素对寄主保护酶及玉米胚根的生长有抑制作用，对玉米胚根细胞膜具有伤害，且能够引起叶片的电渗值发生变化［8-10］。但目前对该毒素的主要成分仍有争议［11-12］。由上可知，对玉蜀黍尾孢菌致病分子机理的研究较少。因此，尽快寻找发掘相关致病基因对于摸清玉米灰斑病菌致病性分子机理，以及玉米灰斑病的防治具有重要意义。

Velvet 蛋白家族最早发现在模式真菌Asper⁃gillus nidulans中［13］，是一类真菌特异的具有Velvet 结构域的蛋白。该家族含有VeA（Velvet），VelB（Velvet like B），VosA（Viability of spores A）和VelC（Velvet like C），具有调控真菌次生代谢及生长和发育的作用。其中Vel B 是Velvet 家族中唯一包含2个Velvet 结构域的成员［14］。近些年研究结果表明，VelB可通过调控Cochliobolus sati⁃vus、Fusarium oxysporum、Curvularia lunata等 子囊菌的次生代谢产物、孢子产生及子实体的形成，最终调控致病性［15-17］。本课题组前期研究利用农杆菌介导遗传转化技术，获得玉米灰斑病菌PH6WC（强致病类型）突变体库，通过形态学和致病性分析，从突变体库中获得一个产孢量下降，致病力明显减弱的菌株，通过Tail-PCR 分析，获得T-DNA 插入位点为VelB基因的启动子区域［18］。

因此，本文克隆玉蜀黍尾孢菌的CzVelB基因序列，并进行生物信息学分析，研究CzVelB基因与玉蜀黍尾孢菌致病性之间的关系。构建ATMT敲除载体，获得敲除转化子，为研究CzVelB对玉蜀黍尾孢菌致病性的分子机制奠定基础，同时也为加快该重大植物病害的防控理论研究提供新的思路和策略。

1 材料和方法

1.1 试验菌株、载体及试剂

本试验所用的玉米灰斑病菌菌株Cz-1，大肠杆菌菌株DH5α、农杆菌为EHA105 由山西农业大学生命科学学院保存，载体构建所需的pPZP100和pCT74 购买于武汉淼灵生物科技有限公司。

本文中所使用2×Es Taq Master Mix，所用试剂盒及抗生素等试剂购于沈阳森宇生物科技有限公司。

限制性内切酶、T4 连接酶、PMD19-T Vector购于Takara 生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 生物信息学分析

根据NCBI 基因组数据库中Colletotrichum graminicola中 的VelB 保 守 区 序 列，从JGI 数 据 库中Cecrospora zeae-maydis 基因组中查询到相似度较高的基因，采用DNAMAN 软件对C. zeae-maydis 基因组中的VelB 蛋白序列进行同源性比对分析，最终确定其基因序列和拷贝数。根据所得到的基因序列，利用多种生物信息学软件对CzVelB基因的性质、结构及功能进行预测。

生物信息学分析软件如表1所示，分别对Cz-VelB 蛋白的氨基酸组成、理化性质、疏水性、跨膜结构、磷酸化位点、亚细胞定位、保守结构域以及信号肽进行分析。在NCBI 数据库中Blast 搜索其他病原真菌VelB 基因序列，使用MEGA 5.0 软件，利用NJ 法构建系统发育树，Bootstrap 分析重复数为1000。

表1 生物信息学分析工具及网址Table 1 Bioinformatics analysis tools and websites

1.2.2 CzVelB 侧翼序列的获得

首先采用CTAB 法［19］对玉米灰斑病菌进行基因组DNA 的提取。其次根据CzVelB 序列，利用DNAMAN 和BioXM 软件设计特异性引物，并结合PCT74 载体上标记基因序列和pPZP100 骨架载体序列，在特异性引物的5'端加入酶切位点，最后利用高保真PCR 技术获得侧翼序列。

引物如下，其中gcc为保护碱基，小写字母并带有下划线为酶切位点碱基。

CzVelB-5F-F1： gccgtcgacTGTGTACCCGACCTCAGTG

CzVelB-5F-F2：gcctctagaTTCCATAAATCGACCGTGAG

HphGFP-F： gcctctagaCAATTAACCCTCACTAAAGG

HphGFP-R： gccggtaccTAATACGACTCACTATAGGG

CzVelB-3R-R1： gccggtaccTCAACCTCGTCCGTCATTCG

CzVelB-3R-R2： gccgagctcAGGTGACAAATTAGGCGCTT

高保真PCR 反应体系：DNA 1.0 μL，5×Phusion HF 10.0 μL，dNTP mixture（10 mM）1.0 μL，primer（10 μM）2.5 μL，最 终ddH2O 定 容 至50.0 μL。

PCR 反应程序：98 ℃，30 s；98 ℃，10 s；Tm，30 s；72 ℃，30 s 共30个 循 环；72 ℃，10 min；4 ℃，保存。

1.2.3 CzVelB 敲除载体构建及验证

以野生菌Cz-1为模板，分别采用CzVelB-5FF1/CzVelB-5F-F2、CzVelB-3R-R1/CzVelB-3RR2 和HphGFP-F/HphGFP-R 扩 增 上 游、下 游 和标记基因片段，扩增产物连入pMD19-T 载体，大肠杆菌转化后，用质粒试剂盒提取质粒，酶切验证。上游片段和pPZP100 经SalⅠ和XbaⅠ酶切后连入，构成重组质粒pPZP100CzVelB-5F。随后用KpnⅠ和SacⅠ酶切下游片段和重组质粒pPZP100CzVelB-5F，构成重组质粒pPZP100Cz-VelB-5F3R，最后分别采用HindIIⅠ和KpnⅠ酶切重组质粒pPZP100CzVelB-5F3R 和标记基因片段，形成敲除载体质粒pPZP100HphGFP-Cz-VelB（图1）。

图1 敲除载体pPZP100HphGFP-CzVelBFig.1 Delection vector pPZP100HphGFP-CzVelB

1.2.4 CzVelB 敲除突变体获得及验证

将上述构建好的敲除载体质粒pPZP100Hph-GFP-CzVelB，利用冻融法转化到农杆菌感受态EHA105 细胞中［18］。将疑似含有敲除载体质粒pPZP100HphGFP-CzVelB 的农杆菌，置于28 ℃培养至菌液浑浊，随后进行PCR 验证。

通过农杆菌介导的方法，将含有敲除载体的农杆菌转化到玉蜀黍尾孢菌基因组中，获得敲除突变体［19］。将转化所得拟敲除突变株进行单胞分离，继代培养后，取长势较好的疑似转化子接种在250 μg·mL-1头孢霉素、200 μg·mL-1潮霉素的PDA培养基中进行验证。随后提取疑似转化子DNA，最终利用PCR 的方法进行验证。

2 结果与分析

2.1 CzVelB 基因序列的获得

根据NCBI 中Colletotrichum graminicola中的VelB 保守区序列（XM_008095148.1），利用JGI 数据库中Cecrospora zeae-maydis 基因组序列，分析获得1个相似度高达95%的VelB 基因，将该基因定为CzVelB。该基因全长为1184 bp。

2.2 CzVelB 生物信息学分析

2.2.1 CzVelB 的蛋白质组成及理化性质

利用DNAMAN 对CzVelB 编码的氨基酸组成进行分析，结果表明该基因编码氨基酸为385个，含有一个开放阅读框。蛋白序列如图2所示。

图2 CzVelB 基因碱基序列及氨基酸序列Fig.2 Gene and amino acid sequence of CzVelB gene

利用ProtParam 对CzVelB 编码的氨基酸进行理化性质分析，结果表明该蛋白42.136 45 kDa，等电点（PI）为9.05，正（Asp+Glu）/负（Arg+Lys）的电荷残基数分别为31 和26，分子式为C1884H2887N519O561S11，总原子数为5862，不稳定性指数值为58.27（＜40 稳定；＞40 不稳定［20］），因此该蛋白属于不稳定蛋白，脂肪指数为67.90，总平均亲水性是-0.434，为亲水性蛋白。

2.2.2 CzVelB 蛋白的亲水性/疏水性分析

利用ProtScale 对CzVelB 蛋白亲/疏水性进行预测分析，结果如图3所示。CzVelB 蛋白在第268位氨基酸上得分为1.15，有最强疏水性；而在第12位上亲水性最强，最低值为-2.10。玉米灰斑病CzVelB 蛋白的亲水性总平均值为-0.434，表明该蛋白为亲水性蛋白。

图3 CzVelB 蛋白的疏水性和亲水性分析Fig.3 Hydrophobic and hydrophilic analysis of CzVelB

2.2.3 CzVelB 蛋白跨膜结构域分析

利用TMPRED 对CzVelB 蛋白的跨膜结构域进行预测分析（图4）。得分越高，则说明该蛋白质位于某一部位的概率就越大。根据预测结果可知该蛋白处于膜外，没有跨膜结构区。

图4 CzVelB 蛋白质跨膜结构域分析Fig.4 Transmembrane analysis of CzVelB

2.2.4 CzVelB 蛋白磷酸化位点分析

磷酸化多数情况下是发生在丝氨酸（Serine，Ser）、苏氨酸（Threoine，Thr）、酪氨酸（Tyrosine.Tyr）等氨基酸的残基上。利用NetPhos 3.1 在线软件在线分析CzVelB 蛋白的磷酸化位点，结果如图5所示。发现在该蛋白上存在有17个丝氨酸激酶磷酸化位点（第21、44、146、149、157、158、169、200、274、285、298、307、323、346、356、365、372 位氨基酸）、5个苏氨酸激酶磷酸化位点（第97、111、122、137、280 位氨基酸）以及7个酪氨酸激酶磷酸化位点（第82、172、202、206、221、283 和360 位氨基酸）。该结果说明，CzVelB 能够被激酶磷酸化，从而实现其功能的调控。

图5 CzVelB 蛋白磷酸化位点分析Fig.5 Phosphorylation sites analysis of CzVelB

2.2.5 CzVelB 蛋白的亚细胞定位

采用PSORT 对玉米灰斑病CzVelB 的亚细胞定位进行预测，结果显示：CzVelB 在细胞核（nuclear）、细胞质（cytoplasmic）、线粒体（mitochondrial）、过氧化物酶（peroxisome）、高尔基体（Golgi apparatus）的分布比例分别为15.5%、7.5%、2%、1%、1%，说明CzVelB 蛋白定位在细胞核中。

2.2.6 CzVelB 蛋白功能结构域

利用NCBI 对CzVelB 蛋白进行蛋白质结构域分析（图6）。其氨基酸序列含有2个Velvet 结构域，具有Velvet 蛋白的典型特征。

图6 CzVelB 蛋白结构域分析Fig.6 Conserved domain analysis of CzVelB

2.2.7 CzVelB 蛋白信号肽分析

利用软件SignalP-4.1 预测玉米灰斑病Cz-VelB 编码蛋白信号肽。C-score、S-score、Y-score分别代表着剪切位点的得分、信号肽的得分和综合酶切位点的得分。信号肽预测结果计算方式为以上3个值均为最大值的位点才是可信度最高的信号肽剪切位点，由图7可知得出该蛋白不存在信号肽位点，目前可以推测该蛋白为非分泌蛋白。

图7 CzVelB 蛋白的信号肽分析Fig.7 The signal Peptide graph analysis of CzVelB

2.2.8 CzVelB 系统进化分析

结合GenBank 和JGI 数据库中Curvularia lu⁃nata等多种植物病原菌的VelB保守区序列，利用MEGA5 对CzVelB进行系统进化分析（图8）。A.flavus、A. niger、Cecrospora zeae-maydis、Emeri⁃cella nidulans聚为一类，Curvularia lunata、Collet⁃otrichum graminicola和Cochliobolus heterostro⁃phus聚为一类，其中Cecrospora zeae-maydis 与A.flavus、A. niger亲 缘 关 系 较 近。CzVelB的 同 源 性分析进一步验证了该基因具有保守性。即推测出的CzVelB功能与A. flavus、A. niger的VelB基因功能相似，参与调控玉蜀黍尾孢菌致病性。

图8 CzVelB 与其他病原菌的系统进化分析Fig.8 Evolutionary analysis of CzVelB amino acid system

2.3 CzVelB 敲除载体构建及验证

根据CzVelB 基因序列设计特异性引物，分别扩增上游片段315 bp 和下游片段281 bp（图9-A，B）。利用HphGFP-F/HphGFP-R 扩增出带有HPH 和GFP 的标记基因片段2600 bp（图9-C）。

图9 CzVelB 侧翼序列和标记基因获得Fig.9 Flanking sequence of CzVelB and HphGFP sequence

利用HindIIⅠ和KpnⅠ验证标，2 条片段大小分别为2915 bp 和6917 bp，说明载体构建成功（图10）。

图10 pPZP100HphGFP-CzVelB 载体验证Fig.10 Confirmation pPZP100HphGFP-CzVelB by digested

2.4 农杆菌转化验证

将疑似含有敲除载体质粒pPZP100HphGFPCzVelB 的农杆菌进行PCR 验证，分别利用Cz-VelB-5F-F1/CzVelB-5F-F2、 CzVelB-3R-R1/CzVelB-3R-R2 和H phGFP-F/HphGFP-R 对 农杆菌进行菌落PCR，最终分别获得315、281 和2600 bp 大小的目标片段（图11）。以上结果表明pPZP100HphGFP-CzVelB 敲除载体已成功转入农杆菌菌株中。

图11 PCR 验证敲除载体pPZP100HphGFP-CzVelB 转入农杆菌Fig.11 PCR verification of transformation of pPZP100HphGFPCzVelB into Agrobacterium

2.5 CzVelB 敲除突变体获得及验证

经含有250 μg·mL-1头孢霉素、200 μg·mL-1潮霉素的PDA 抗性培养基筛选获得敲除突变体（图12）。并根据玉蜀黍尾孢菌VelB基因载体构建过程中设计的特异性引物，对ΔCzVelB进行PCR 验证。利用CzVelB-5F-F1/CzVelB-3R-R2 引物，以野生型菌株Cz-1 基因组为模板，扩增出的全长片段大小为616 bp，突变体扩增出片段大小为3196 bp；利 用CzVelB-5F-F1/HphGFP-R 引 物，以野生型菌株Cz-1 基因组为模板为扩增出条带，但突变体扩增出2915 bp 大小的片段，与预期大小一致（图13），证明获得了CzVelB的敲除突变体。

图13 PCR 验证敲除突变体Fig.13 PCR identification of ΔCzVelB

3 讨论与结论

本文采用生物信息学手段分析CzVelB 蛋白保守结构域表明，其氨基酸序列含有2个VelB 蛋白的保守结构域-Velvet 结构域，具有Velvet 蛋白的典型特征。已有研究表明，Aspergillus nidu⁃lans、Fusarium oxysporum、Aspergillus flavus等 真菌的VelB 蛋白均存在Velvet 结构域，且结构域保守［16，21］。通过结合系统发育树进一步分析，C. ze⁃ae-maydis 与A. flavus、A. niger亲 缘 关 系 较 近。因此，玉蜀黍尾孢菌具有典型的VelB 蛋白功能。

另外，针对CzVelB 蛋白理化性质、亲水性、疏水性等分析，结果表明该蛋白为亲水性蛋白，无跨膜结构区，这与Ustilago maydis和Cochliobolus heterostrophus的分析结果相一致［22-23］。

亚细胞定位结果表明，在分析玉米大斑病菌VelB 蛋白时发现，该蛋白位于细胞质中，因此可能需要从细胞质中转运至细胞核中，进而发挥作用［24］。但本文分析CzVelB 蛋白位于细胞核中，且不存在信号肽，这与杨峥的研究结果不一致。针对蛋白磷酸化结果分析，均发现CzVelB 蛋白存在大量的磷酸化位点，能被激酶磷酸化，从而实现其功能的调控。因此推测CzVelB 蛋白参与调控玉蜀黍尾孢菌刺激代谢途径。

国内外研究表明，ATMT 技术是目前丝状真菌遗传转化最常用的手段，因此获得目标基因的敲除突变体为后续研究该基因的功能奠定基础。本文根据玉蜀黍尾孢菌的VelB基因序列，设计特异性引物，扩增出侧翼片段和标记基因片段，并成功连入骨架载体中，构建CzVelB基因的敲除载体pPZP100HphGFP-CzVelB，最终利用ATMT 技术获得ΔCzVelB，为进一步研究该基因的功能分析提供基础材料。