内蒙古苜蓿锈菌越冬的分子定量检测

马丽杰，武占敏，张俊杰，吕 文，张 伟，杨政伟，卓玛曲措，胡小平

(1.鄂尔多斯生态环境职业学院，内蒙古鄂尔多斯 017010；2.西北农林科技大学 植物保护学院，农业农村部黄土高原作物有害生物综合治理重点实验室，陕西杨凌 712100；3.鄂尔多斯市植保植检站，内蒙古鄂尔多斯 017010；4.鄂尔多斯市农产品质量安全中心，内蒙古鄂尔多斯 017010；5.西藏农牧学院 植物科学学院，西藏林芝 860000)

苜蓿是世界上种植面积最大的豆科牧草，也是中国近年来大面积推广和种植的优良牧草[1]。内蒙古是国内五大牧草种植区之一，苜蓿商品草种植面积和产量居全国第二[2]。由苜蓿条纹单孢锈菌(Uromycesstriatus)引起的苜蓿锈病是中国北方苜蓿种植区普遍发生的重要流行性叶部病害，发生严重时可导致苜蓿减产10%～30%，种子减产50%[3-4]，病叶的鲜质量比健康叶片减少44%，粗蛋白含量下降18%，粗纤维含量增加15%[5]，苜蓿茎叶枯黄不能饲用[3]，大幅度降低苜蓿产量和品质。内蒙古中部地区苜蓿最后一次刈割一般在10月下旬结束，残存的苜蓿锈菌很可能在苜蓿或其转主寄主上潜伏侵染并越冬，成功越冬的病菌可成为翌年病害流行的初侵染源。关于苜蓿锈菌的越冬部位及越冬形态，目前有四种观点：第一，苜蓿锈菌可在转主寄主乳浆大戟等的地下器官内以菌丝体形态越冬[6-8]；第二，苜蓿锈菌可以冬孢子形态在病残体上越冬[9]。第二年侵染其转主寄主大戟并在其上完成有性世代，形成锈孢子后，由锈孢子转染到苜蓿上，使之发病[10]；第三，苜蓿锈菌可以直接在苜蓿根茎内越冬[3]；第四，在冬季较温暖的地区如伊拉克[11]，苜蓿锈菌也能以夏孢子形态越冬[10,12]。

上述关于苜蓿锈菌越冬部位的研究，大多根据田间调查经验推断所得，缺乏直接试验证据。目前，内蒙古中部地区苜蓿锈菌越冬的菌量和越冬部位还不清楚。因此，本研究建立一种基于RNA水平的real-time qPCR技术，对内蒙古中部5个苜蓿主产区返青后植株内的锈菌量进行检测，明确苜蓿锈菌越冬菌量和越冬部位，为苜蓿锈病的综合防控提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 调查点选择

2018-2020年，选择内蒙古中部5个苜蓿主产区作为调查点，自东向西分别为乌兰察布市、呼和浩特市、包头市、鄂尔多斯市和巴彦淖尔市 (图1)。

图1 内蒙古苜蓿锈病调查点

1.2 试验方法

1.2.1 植株标记 2018-2020年每年11月中下旬，对每个调查点采用5点取样法标记50株冬前发病的植株，翌年4月初，从冬前标记现已返青的植株上从上向下剪取5 cm长度的植株材料装于含有RNAlaterTMSoIn保存溶液(Invitrogen, AM7021)的10 mL离心管中，备用。

1.2.2 田间样品处理 将田间样品从离心管中取出，用吸水纸吸掉残留溶液，用蒸馏水反复冲洗干净并吸干水分，剪碎混匀，称取100 mg，备用。

1.3 建立RNA水平的Real-time qPCR体系

1.3.1 RNA提取、纯化并反转录成cDNA 称取发病的苜蓿锈病叶片100 mg(约5片)，液氮研磨成粉末，用SV Total RNA Isolation System(Promega)试剂盒提取总RNA。用Nanodrop 2000(Thermo Fisher)仪器测RNA总浓度。最终获得总RNA，其浓度为145 ng/μL，OD260/280为2.1，OD260/230为2.2，RNA完整性好。根据Thermo scientific ReverAid First Stand cDNA Synthesis kit试剂盒进行RNA纯化和反转录。

1.3.2 苜蓿锈菌特异性引物设计与合成 根据文献[13-14]报道，Eric Kemen设计特异性引物将苜蓿锈菌(Uromycesstriatus)和同源性较高的蚕豆锈菌(Uromycesfabae)进行区分，引物合成见表1的Us-RTP1-NLS1。采用Us-RTP1-NLS1的下游引物，并在Us-RTP1基因组上重新设计上游引物，合成新引物Us-PTP1-NLS2(表1)。通过序列比对软件BioEdit比对2对引物，结果显示2对引物只有2个碱基的差异(图2)。将2对引物分别在NCBI上进行比对，发现其与苜蓿上常见的其他4种叶部病害苜蓿褐斑病(苜蓿假盘菌Pseudopezizamedicaginis)，苜蓿叶肿病(小光壳属Leptosphaerulinabriosiana)，苜蓿灰斑病(尾孢菌属Cercosporamedicaginis)和苜蓿炭疽病(炭疽属Colletotrichumspp.)均无匹配。

图2 两对引物在苜蓿锈菌基因组上的比对

表1 苜蓿锈菌特异性引物

1.3.3 苜蓿组织特异性引物合成 选用文献[15]中扩增苜蓿叶片组织基因PDF2、UBC和Ubiquitin的3对引物进行合成并扩增(表2)。

表2 苜蓿叶片组织特异性引物

1.3.4 标准曲线的构建 根据UltraSYBR Mixture(CWBIO)试剂盒说明书，进行标准曲线的构建。以获取的初始cDNA为模板进行10倍梯度稀释，最终获得2.03、2.03×10-1、 2.03×10-2、2.03×10-3、2.03×10-4、2.03×10-5、 2.03×10-6、2.03×10-7ng/μL 8个浓度梯度cDNA，分别利用苜蓿锈菌特异性引物和苜蓿叶片组织特异性引物进行qPCR扩增，每个梯度样品重复3次。

1.4 指标测定方法

每个cDNA样品由苜蓿锈菌cDNA和苜蓿叶片组织cDNA组成。经标准曲线换算，以分子病情指数(molecular-detected disease index, MDI)进行定义并测算[16]：

MDI=苜蓿锈菌cDNA量(pg)/苜蓿叶片组织cDNA量(ng)×100%

1.5 返青后苜蓿植株发病率调查

在6月中旬，利用5点取样法对各监测点苜蓿锈病发病情况进行调查。每点调查20株，每个监测点共调查100株，记录植株发病率。

植株发病率(%)=发病的植株数/调查的总株数×100%

1.6 数据分析

采用SPSS 17.0软件对所测数据进行统计分析，用“平均值±标准误”的形式表示测定结果，分别对同一年份不同地区和同一地区不同年份的分子病情指数进行单因素方差分析，用S-N-K法对各测定数据进行多重比较，对不同地区不同年份进行单变量方差分析，采用Excel 2010制图。

2 结果与分析

2.1 基于RNA水平的real-time qPCR体系构建

2.1.1 引物特异性验证 利用普通PCR对2对苜蓿锈菌引物的特异性进行验证，2对引物均可以扩出目标条带且位置大小一致(图3-A)，后续以Us-RTP1-NLS2引物进行锈菌qPCR定量研究。利用苜蓿叶片特异性引物进行普通PCR扩增，PDF2引物扩增条带亮(图3-B)，后续以PDF2引物进行苜蓿叶片组织qPCR定量研究。

A.苜蓿锈菌 Us-RTP1基因的扩增片段条带，其中，泳道1是阴性对照，泳道2和3是相同引物Us-RTP1-NLS1扩增条带，泳道4和5是相同引物Us-RTP1-NLS2扩增条带，泳道6是Marker

2.1.2 标准曲线构建 以2.03、2.03×10-1、 2.03×10-2、 2.03×10-3、2.03×10-4ng/μL cDNA为模板进行qPCR，构建发病叶片中苜蓿锈菌cDNA标准曲线(图4-A)。以2.03×10-3、2.03×10-4、2.03×10-5、2.03×10-6、2.03×10-7ng/μL cDNA为模板进行qPCR，构建发病叶片组织cDNA标准曲线(图4-B)。样品中苜蓿锈菌的量远低于苜蓿叶片组织的量。

A.苜蓿锈菌cDNA标准曲线；B.苜蓿叶片组织cDNA标准曲线

2.2 苜蓿锈菌越冬菌量的测定

2.2.1 不同地区间越冬菌量比较 2018-2020年，利用建立的RNA水平real-time qPCR体系对内蒙古5个苜蓿主产区样品进行定量检测。乌兰察布市、呼和浩特市、包头市、鄂尔多斯市、巴彦淖尔市3 a平均分子病情指数MDI分别为 0.139、0.284、0.196、0.569、0.280。其中，鄂尔多斯市3 a平均MDI显著高于其他4个地区的平均MDI(P=0.005)(图5)。

不同小写字母代表在0.05水平差异显著

2.2.2 不同年份间越冬菌量比较 2019年，检测到5个地区苜蓿锈菌平均MDI为0.43，显著高于2018年的MDI 0.24(P<0.05)和2020年的MDI 0.13(P<0.001)。2018年，5个地区的平均MDI无显著差异(表3)。2019年，鄂尔多斯市的平均MDI为1.02，显著高于其他4个地区(P< 0.001)。2020年，鄂尔多斯市的平均MDI为0.20，与巴彦淖尔市和呼和浩特市无显著差异，但显著高于包头市(P=0.004)和乌兰察布市(P=0.001)。

表3 各地区在不同年份间苜蓿锈菌分子病情指数MDI的方差分析

以苜蓿锈菌平均分子病情指数MDI作为因变量，对3 a(2018-2020年)、5个地区(乌兰察布市、呼和浩特市、包头市、鄂尔多斯市、巴彦淖尔市)分子病情指数MDI进行方差分析(表4)，结果显示，年份和地区内均存在极显著差异(P< 0.001)，年份*地区之间存在显著差异(P< 0.05)。

表4 不同处理不同年份不同地区苜蓿锈菌分子病情指数MDI的方差分析

2.3 苜蓿锈菌越冬菌量与返青后植株发病率的关系

2018-2020年，对返青后苜蓿植株发病率进行田间调查统计，并与当年苜蓿锈菌越冬菌量进行比较，各监测点在相同年份下的分子病情指数和返青后植株发病率趋势基本一致(图6)。对2018-2020年的苜蓿锈菌越冬菌量和返青后植株发病率进行双变量相关性检测，结果显示，苜蓿锈菌越冬菌量和返青后苜蓿植株发病率呈正相关，皮尔逊相关性为r=0.806，P=0.000< 0.001。

图6 苜蓿锈菌越冬锈菌量与返青后植株发病率比较

3 结论与讨论

Real-time qPCR技术是一种具有高度灵敏性和准确性的核酸定量监测技术。它是利用已知浓度的标准样品构建标准曲线，定量获得未知样品的Ct值，再通过标准曲线上计算出未知样品的起始量[17]。该方法被广泛应用于动植物真菌、病毒、细菌等微生物的RNA和DNA检测。Ma等[18]利用RNA水平的real-time qPCR技术建立检测田间越冬小麦条锈菌初始菌量的体系。郑亚明[19]和闫佳会等[16]分别基于DNA水平的qPCR技术对田间潜伏侵染的小麦白粉菌量和条锈菌量进行检测。Dhar等[20]利用qPCR对空气中霜霉病菌的孢子量进行实时监测，确定了病害防控阈值(8.55个/m3)。本研究建立的RNA水平的qPCR技术可用于定量检测苜蓿锈菌越冬的初始菌量，能在田间苜蓿见病前2个月检测到活体苜蓿菌量，结合本研究结果，苜蓿锈菌越冬菌量与返青后苜蓿植株发病率呈正相关，说明建立苜蓿锈菌越冬菌量qPCR检测技术的必要性，为确定病害发生的重点区域及科学防控方法提供理论依据。

苜蓿锈菌是严格的专性寄生真菌，苜蓿锈病的分布与苜蓿种植区基本一致。1995年，侯天爵等[7]初步探究内蒙古苜蓿锈病的发生和分布范围，其中，呼和浩特市和赤峰市(北纬约40°～41°)发病较为严重，锡林浩特市(北纬约44°)发病较轻，并提出苜蓿锈病的发生随纬度升高而病害减轻的观点。本研究的5个调查点中，乌兰察布市的纬度(北纬约41.56°)最高，鄂尔多斯市的纬度(北纬约39.82°)最低，结合Real-time qPCR定量结果，乌兰察布市的越冬苜蓿锈菌量最低，鄂尔多斯市的最高，结果与前人表述一致。但包头市、巴彦淖尔市、呼和浩特市的越冬苜蓿锈菌量分布与地理纬度关系不明显。病原菌的越冬菌量与品种抗冻性、温度和湿度等相关气象因子、秋季发病程度、越冬部位、种植环境等因素密切相关，单从地理纬度区分意义不大，仍需要通过荧光定量PCR技术才能获得最准确可靠的越冬菌量。

本研究在返青后苜蓿植株上部5 cm材料中检测到苜蓿锈菌，说明苜蓿锈菌可以在苜蓿地下根茎组织中顺利越冬。这与侯天爵提出的苜蓿锈菌可以直接在苜蓿茎内越冬的观点一致[3]。

温度是影响苜蓿锈菌越冬的关键气象因子。2019年的越冬苜蓿锈菌量显著高于2018和2020年的。结合气象资料分析，除包头市外的4个调查点在2019年11月中旬到翌年1月中旬的日平均温度分别为乌兰察布市(-11.37 ℃)、呼和浩特市(-8.63 ℃)、鄂尔多斯市(-6.91 ℃)、巴彦淖尔市(-7.47 ℃)，均高于同一地区在2018年和2020年该监测段的日平均温度。包头市在2018年的越冬锈菌量达到3 a中最大值，包头市2018年该监测段的日平均温度为2.55 ℃，高于2019年(-10.02 ℃)和2020年(-15.61 ℃)的日平均温度。本研究显示11月中旬到翌年1月中旬的日平均温度与越冬苜蓿锈菌量呈正相关，温度对锈菌越冬的影响仍需进一步研究证明。

关于苜蓿锈菌越冬的具体温度研究，目前未见报道。但与其同属于锈菌目柄锈菌科的小麦条锈菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)的越冬温度报道较多，如当翌年1月的平均气温低至 -6 ℃～-7 ℃时，小麦条锈菌越冬困难[21-25]，但当有积雪覆盖时，空气温度下降至-10 ℃小麦条锈菌菌丝体仍能顺利越冬[21, 26-27]。Ma等[18]的研究表明，田间小麦条锈菌越冬存活率随着温度的降低而降低。室内试验证明，小麦条锈菌在温度 -20 ℃～-15 ℃的条件下处理12 h后仍存活，但存活率低于-10 ℃及以上温度的锈菌存活率[28]。本研究统计了各调查点2020年11月中旬到翌年1月中旬的日平均温度≤-10 ℃的积累时间，乌兰察布市(71 d)、呼和浩特市(51 d)、包头市(70 d)、鄂尔多斯市(37 d)、乌兰察布市(58 d)。结合real-time qPCR定量结果分析，2020年乌兰察布市和包头市的越冬苜蓿锈菌量显著低于其他地区。本研究显示，低温积累时间也是影响苜蓿锈菌越冬的重要因子，低温积累时间越长，越冬锈菌量越少，但该结论还需要通过试验进一步研究证明。