自交与异交象牙参属植物的蜜腺结构及其生物学意义

王雯婧 陈虹帆 邵国峻 廖 虹 赵建立* 李庆军

（1. 云南大学云南省植物繁殖适应与进化生态学重点实验室，昆明 650500；2. 云南大学生态与环境学院生态学与进化生物学实验室，昆明 650500）

花蜜作为被子植物向传粉者（如蜜蜂）提供的重要报酬，由蜜腺经过复杂而有序的生化过程合成，是植物与昆虫之间建立互惠关系的关键驱动力。研究表明，花蜜的成分、分泌量、分泌时间主要受基因调控，具有物种和/或器官/组织特异性，并与传粉者的种类、拜访时间及拜访行为相对应。从进化的角度来看，花蜜在植物生殖策略中起着重要作用，其分泌的相似性与差异性是植物适应传粉者偏好的结果，植物以此获得最高的传粉效率、加强自身的繁殖能力和种群稳定性。因此，作为花蜜合成与分泌源头的蜜腺，对有花植物具有重要的生态价值，在植物生态适应及多样化方面发挥着重要作用。

蜜腺，大多由一层特化的表皮细胞、多层特化的薄壁组织及维管束构成，与植物的木质部和韧皮部直接关联，体积较小、内部结构简单。不同于花内主要器官（萼片、花瓣、雄蕊和心皮）沿着花托相对高度保守的排列顺序，蜜腺可在花托的任何位置或与任何花器官相联系的位置平齐、凸起、内藏分布。例如，在毛茛科（Ranunculace⁃ae）植物耧斗菜（）中，蜜腺位于花距顶端的内表面；茄科（Solanaceae）植物矮牵牛（）的蜜腺呈环状，围绕子房基部；豆科（Leguminosae）植物刺槐（）的蜜腺位于雄蕊与子房之间的花托上。在着生位置、形状、数量、颜色等方面高度多样的蜜腺，一定程度上反映了植物类群进化趋势的多样化。因此，对蜜腺结构特征的研究，有助于理解相应类群的进化规律及其繁殖特性、探讨植物与传粉动物间的协同进化关系，从而深入理解生物多样性的起源与维持机制。

象牙参属（）为多年生雌雄同株草本植物，是姜科（Zingiberaceae）中唯一能分布于高山寒温带气候的类群。该属植物已知约有20 种，为喜马拉雅山脉和我国西南地区所特有，通常分布于海拔1 200～4 850 m 的生境中。针对象牙参属植物开展的传粉生物学研究，为理解喜马拉雅山脉和我国西南地区植物多样性的起源与维持提供了重要案例。例如，分布于喜马拉雅山脉的紫花象牙参（）与长喙传粉昆虫之间形成协同演化关系的发现，加深了人们对动植物互作在物种局域适应方面的认识。西南地区的象牙参属植物在缺乏有效传粉者的情况下进化出了多样的繁殖特性，如大花象牙参（）和早花象牙参（）依靠蜜蜂传粉，长柄象牙参（）具有延迟自交的特性，无柄象牙参（）呈现出主动自交的能力。基于目前已有的研究和本研究的野外观测发现，除无柄象牙参外，其余象牙参属物种均能产生花蜜。在长期缺少有效传粉者的情况下，无柄象牙参为繁衍后代，进化出了通过弯曲柱头接触花粉的方式实现主动自交。虽然目前象牙参属植物传粉生物学方面的研究均涉及花蜜的测定，但缺乏对蜜腺的深入了解，而解析象牙参属中具有不同繁殖特性物种间蜜腺结构的差异是深入理解该属植物在高海拔环境中繁殖与进化适应的重要一环，同时也可为理解高山地区植物繁殖多样性的形成提供理论依据。

本研究以异交物种早花象牙参和主动自交物种无柄象牙参为材料，通过比较解剖学的方法结合早花象牙参花蜜量和糖分浓度的测定，以回答如下2 个科学问题：（1）2 个物种的蜜腺结构存在怎样的差异？（2）从形态学角度来看，无柄象牙参蜜腺不分泌花蜜的原因是什么？

1 材料与方法

1.1 试验材料

早花象牙参花期在5—6 月，花深紫红色或黄色，花冠管纤细且较短，花葶明显伸出叶鞘之上（见图1A），花柱线形无毛，柱头黄白色具睫毛（见图1B）。2019年5月下旬于云南省丽江市丽江高山植物园哈冷古水库附近（27°3′N，100°11′E）的自然居群，采集当日开花的早花象牙参植株的蜜腺。无柄象牙参花期在7—8 月，花紫红色或深紫色，花葶较短且隐藏于叶鞘内或为突出的短梗（见图1C），花柱白色或紫色线形，柱头具睫毛扩大为漏斗状并弯曲成钩状（见图1D）。2019年7月上旬于云南省丽江市甘海子（27°3′N，100°14′E）的自然居群，采集当日开花的无柄象牙参植株的蜜腺。

图1 早花象牙参和无柄象牙参花部形态A.早花象牙参野外生境下的植株；B.早花象牙参具睫毛成漏斗状的柱头；C.无柄象牙参野外生境下的植株；D.无柄象牙参朝花粉囊方向勾状弯曲的柱头Fig.1 Flower morphology of R.cautleoides and R.schneideriana A.Flowers of R. cautleoides；B.Funneled stigma of R. cautleoides with eyelashes；C.Flowers of R. schneideriana；D.The hooklike stigma of R. sch⁃neideriana bent to the direction of anthers

固绿FCF、藏花红T（碱性红2）购自上海麦克林生化科技有限公司（上海），石蜡购自Leica Bio⁃systems Richmond，Inc（美国），中性树胶购自北京索莱宝科技有限公司（北京），甲醛溶液（分析纯）购自成都金山化学试剂有限公司（成都），二甲苯（分析纯）购自天津市风船化学试剂科技有限公司（天津），无水乙醇（分析纯）购自广东光华科技股份有限公司（汕头），冰醋酸（分析纯）购自广东省化学试剂工程技术研究开发中心（汕头），粘附载玻片、显微镜盖玻片购自江苏世泰实验器材有限公司（海门）。实验仪器包括：Smartzoom 5 超景深宏观数码显微镜购自卡尔蔡司显微镜有限公司（德国），石蜡包埋机、轮转式切片机、Leica Micro⁃systems CMS GmbH、游标卡尺购自徕卡显微系统有限公司（上海），PXS-A 解剖镜购自上海普丹光学仪器有限公司（上海），手动移液枪购自德国艾本德股份公司（上海），ATAGO 手持糖度仪（日本），电热恒温培养箱购自上海齐欣科学仪器有限公司（上海）等。

1.2 试验方法

取新鲜象牙参植株的蜜腺，在超景深显微镜下进行拍照观察。

为了解早花象牙参和无柄象牙参蜜腺的内部结构，本研究对二者的蜜腺进行了石蜡切片观察。用体积分数50%乙醇配制的FAA溶液固定并保存材料，然后经50%、70%、85%、95%、100%系列浓度梯度乙醇逐级脱水，二甲苯透明后用石蜡包埋。包埋的蜡块经过修块后使用莱卡RM2245 半自动切片机连续切片（厚度为8～10 μm），1%番红—固绿染色，封片后，用莱卡生物显微镜拍照。

在实验样地中随机选取前1 d 标记、套袋的100 株当日开花个体，依次去除叶片、苞片、萼片、花冠管后将蜜腺暴露出来，随后利用游标卡尺测量蜜腺长度，通过检验进行差异显著性分析。

在晴天的下午进行早花象牙参花蜜体积及糖分浓度的测定。当日16：00—17：00 随机选取150株、每株保留1朵即将开放的花苞进行标记、套袋，以确保测量对象均为当日开花的个体，同时排除其他因素（例如：传粉者拜访植株吸取花蜜等）的干扰。次日下午（间隔约24 h），依次取下每朵花的套袋，剥离苞片、萼片后，沿花冠管中部将花分为2 个部分，利用0.1～2.5 μL 量程的移液枪吸取花蜜估读蜜量，同时将吸取的花蜜收集于1.5 mL 离心管中。待150株测量完成后，将收集的花蜜置于手持糖度仪中读取糖浓度。最后，通过计算平均值获得单花花蜜的分泌量及糖分浓度。

2 结果

2.1 花蜜的分泌

在开花期内（约8 d），早花象牙参花冠管中有大量无色透明的花蜜，其花蜜分泌持续整个花周期。结果显示，当日开花的早花象牙参单花的花蜜分泌量平均约为1.3 μL，最多可达到4.1 μL（见图2）。在野外环境中19.4 ℃条件下，利用手持糖度仪测定收集于离心管中全部花蜜的糖浓度，约为20%。与此相比，无柄象牙参蜜腺表面、花冠管基部及花冠管内均未见花蜜（见图2）。

2.2 蜜腺的外观形态

象牙参属植物的蜜腺体积较小，位于子房上部，包裹于花冠管内，具有平坦的外观，其表面与子房不同，无表皮毛（见图3：A～B）。超景深显微镜观察及野外测量数据显示：早花象牙参蜜腺呈2条明亮的黄色圆柱体，排列紧密，二者等长或一条稍长（见图3C），平均约为4.16 mm（标准差：1.00，见图2）。无柄象牙参蜜腺成2 条短棒状，其尖端扁平成淡绿色，基部格纹明显成白色，2 条蜜腺缩短变粗（见图3D），长度约为2.69 mm（标准差：0.81，见图2）。早花象牙参的蜜腺显著长于无柄象牙参（<0.001，见图3）。概括来看，早花象牙参与无柄象牙参的蜜腺在大小、颜色、形状方面出现明显差异。

图2 早花象牙参与无柄象牙参蜜腺长度及花蜜量的比较Fig.2 Comparisons of nectary length and nectary volume between R.cautleoides and R.schneideriana

图3 早花象牙参与无柄象牙参蜜腺的外部形态A、C.早花象牙参蜜腺的位置及形态；B、D.无柄象牙参蜜腺的位置及形态Fig.3 Morphology of nectaries in R.cautleoides and R.schneideriana A，C.The position and morphology of nectaries in R.cautleoides；B，D.The position and morphology of nectaries in R.schneideriana

2.3 蜜腺的内部结构

从纵切面来看，早花象牙参的蜜腺由分泌表皮和其下的泌蜜组织构成。分泌表皮由1 层排列紧密同时又保留一定空隙的细胞组成，表面无明显凸起或凹陷，淀粉粒沉积且细胞质浓厚；泌蜜组织较发达，由10～13 层多边形薄壁细胞组成，呈现出明显的细胞形态分化及分布区域特化；输导组织位于蜜腺中央，包裹于薄壁细胞内，与表皮细胞形态特征相似，成带状或片状连接（见图4：A～B）。从横切面来看，表皮细胞内有淀粉粒出现；下方薄壁组织具有大液泡及成束分布的维管组织；淀粉粒散布于中央致密分布的韧皮部（见图4C）。

无柄象牙参蜜腺的分泌表皮细胞排列紧密且无胞间间隙，体积增大、细胞壁清晰，未见明显淀粉粒且细胞质浓度较低；中央输导组织出现木质化的导管（见图4：D～E）。横切面可见，其表皮细胞与花柱的细胞形态相似，泌蜜组织内有较多大液泡（见图4F）。

3 讨论

3.1 蜜腺的形态结构

姜科植物的蜜腺通常为2枚，位于子房顶部且形状各异，例如：山姜属马来良姜（）的蜜腺为近球状；山柰属海南三七（）的蜜腺呈细长线形。与其他姜科植物一样，早花象牙参与无柄象牙参的花蜜腺也有2枚，近圆柱状，为结构蜜腺，包裹于花冠管内基部、子房上部，由分泌表皮、泌蜜组织及维管组织构成。无柄象牙参的蜜腺显示出一定程度的退化，显著短于早花象牙参。从早花象牙参蜜腺石蜡切片，可清楚地看出其薄壁组织与维管组织中2种不同细胞的形态结构和分布位置的差异（见图4：A～C）。而无柄象牙参虽保留薄壁细胞和维管组织形态、分布的分化（见图4：E～F），但分泌表皮进一步薄壁化。

早花象牙参与无柄象牙参表皮细胞的最大区别在于：早花象牙参表皮细胞间有空隙、细胞质浓厚、淀粉粒储存较多（见图4B），而无柄象牙参蜜腺表皮细胞排列紧密、细胞质薄、淀粉粒储存较少甚至无，其形态更趋向于薄壁细胞（见图4：E～F）。相关研究表明，花蜜的分泌取决于蜜腺组织结构及其发达程度，主要分为2 种途径：一种是韧皮部运输的碳水化合物以淀粉粒形式储存或直接运送到泌蜜组织，在开花前经泌蜜组织加工后分泌出蜜腺外；另一种是蜜腺通过本身所含叶绿体合成碳水化合物并以淀粉粒形式储存，经水解加工后分泌。无论哪一种途径，均要经过淀粉的形成及水解过程。与此同时，花蜜在进入花冠管时均要通过表皮细胞。早花象牙参表皮细胞间的空隙可为泌蜜提供通道，而无柄象牙参蜜腺虽保留了部分输送淀粉的能力，但表皮细胞可能失去花蜜的泌出或是（同时）水解淀粉的功能。

图4 早花象牙参与无柄象牙参蜜腺石蜡切片A～C.早花象牙参蜜腺；D～F.无柄象牙参蜜腺；A、D.放大40倍的纵向切片；B、E.放大200倍的纵向切片；C、F.横切面放大100倍；黄色三角所指为蜜腺，黄色箭头所指为维管组织，黑色箭头所指为分泌表皮细胞间隙，紫色三角所指为花柱结构Fig.4 R.cautleoides and R.schneideriana’s paraffin section of nectary A−C.Nectary of R. cautleoides；D−F.Nectary of R. schneideriana；A，D.Longitudinal section microscope magnified by 40 times；B，E.Longitudinal section microscope magnified by 200 times；C，F.Horizontal section and magnified 100 times；Yellow triangle indicates nectary，yellow arrow indi⁃cates vascular tissue，and black arrow indicates secretory epidermal intercellular space，purple triangle indicates the style structure

基于以上结构差异推测，无柄象牙参蜜腺的内部结构出现不同程度的退化，这可能导致相关区域功能缺失，使蜜腺无法实现分泌花蜜的功能。

3.2 蜜腺退化与主动自交的形成

被子植物中约有20%的物种表现出以自交为主要繁殖策略的特性，在授粉者缺乏或花粉传递效率低的选择压力下，植物通过主动自交实现繁殖。自交的生态效益和成本取决于自交发生的方式、时间及其生态环境。象牙参属植物具有较长的花冠管，较艳的花展示，具备长喙昆虫传粉综合征。喜马拉雅山脉地区紫花象牙参与长喙传粉昆虫之间协同演化关系的形成，充分体现了该类长喙昆虫传粉综合征的独特作用。即使喜马拉雅山脉的其他象牙参属物种没有长喙昆虫的拜访，但该属植物仍可将花蜜作为熊蜂（）访花的报酬实现完全异交繁殖，如图杰象牙参（）和耳叶象牙参（）；也可以在有花蜜的情况下通过主动自交实现繁。已有研究报道，分布于横断山地区的象牙参属植物，包括大花象牙参、早花象牙参和长柄象牙参能分泌花蜜。并且，基于本研究野外的观察发现，苍白象牙参（）、藏象牙参（）、先花象牙参（）、大理象牙参（）、苍山象牙参（）和昆明象牙参（）均没有发现有效的长喙传粉昆虫为它们传粉，但这些物种均能分泌花蜜。此外，除无柄象牙参外，高山象牙参（）、长柄象牙参、藏象牙参均能通过自交实现繁殖，但这些物种的雌蕊并不会发生弯曲，而是通过花粉接触柱头实现主动自交，同时它们的蜜腺也保留了泌蜜能力，能为传粉者提供报酬。换言之，除无柄象牙参外，其余的象牙参属植物都具有泌蜜功能。由此我们推测，具有完整蜜腺且能分泌花蜜是象牙参属植物的原始特征，而无柄象牙参蜜腺的退化是在无传粉者的情况下，经过长期自然选择的结果。

在野外调查中我们发现，无柄象牙参主要分布于开阔较为干旱的林缘，花期与当地雨季高峰期重叠，这可能是导致有效传粉者缺乏的原因之一。在开花过程中，其柱头主动向花粉囊弯曲完成自花授粉，付出较小代价的同时获得了巨大的繁殖保障。由于花蜜中含有大量的糖分、氨基酸及其他物质，其分泌过程需要消耗植物约37%的能量。在长期缺乏有效传粉者的情况下，无柄象牙参在进化过程中可能为了减少无效的繁殖投入，在自交确保繁殖成功的情况下使蜜腺退化、泌蜜功能丢失。

综合来看，本研究初步探究了象牙参属植物蜜腺的类型和结构，对比分析了早花象牙参与无柄象牙参蜜腺形态结构的异同，为理解象牙参属植物泌蜜的结构基础提供了较为直接的证据，也为理解象牙参属植物繁殖多样性的形成提供了形态学证据。虽然本研究仅比较了不同繁殖特性物种间成熟蜜腺的形态差异，但该研究引出了有关象牙参属植物蜜腺更深层次的问题，比如这2种象牙参属植物的蜜腺在发育过程中是否存在差异？导致这些差异的分子基础是什么？这些问题的解决，可为理解象牙参属植物繁殖多样性的起源与进化适应机制提供更深入的证据。

致谢 衷心感谢中国科学院昆明植物所丽江高山植物园在材料采集和野外观察试验上提供的帮助。