炮制对天南星毒性成分草酸钙针晶及凝集素蛋白含量的影响

王贺鹏,郁红礼,2,3,吴皓,2,3,谢雨薇,陶兴宝,曾平,程砚秋,王彩霞,刘冰冰,张萍

(1.南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023;2.江苏省中药炮制重点实验室,江苏 南京 210023;3.国家教育部中药炮制规范化及标准化工程研究中心,江苏 南京 210023;4.中国食品药品检定研究院,北京 100050)

天南星为天南星科植物天南星Arisaemaerubescens(Wall.) Schott、异叶天南星ArisaemaheterophyllumBl.或东北天南星ArisaemaamurenseMaxim的干燥块茎。天南星生品有毒,具有强烈的刺激性毒性,误服会导致剧烈的唇舌刺痛感、流涎、口舌肿胀、咽喉疼痛等[1],因此临床多用炮制品。

《中国药典》2020年版天南星质量标准缺少毒性控制指标。课题组前期研究发现,天南星中含有的具有特殊结构的针晶复合物是其主要的刺激性毒性成分,该针晶复合物是由草酸钙针晶及凝集素蛋白共同构成[2-5]。针对目前天南星毒性成分控制研究的不足,结合本课题组前期的研究成果,本研究采用HPLC法对35批不同产地、不同批次天南星样品炮制前后针晶含量进行分析测定,采用Western blot法对32批天南星炮制前后凝集素蛋白进行检测,并建立相应限度标准,以期为天南星毒性控制指标的建立提供参考。

1 材料

Waters 2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司),包括Waters 2489 UV检测器及Waters Empower Pro色谱工作站。高速离心机(美国Thermo公司)；BP211D电子天平(德国Sartorius公司)。HWS-26电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)。Milli-Q纯水仪(美国Millipore公司)。凝胶成像系统(上海天能科技有限公司);高速冷冻离心机(美国Thermo公司)。

草酸基准试剂(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号：O111918)、磷酸(AR,上海麦克林生化科技有限公司，货号：P816337)、盐酸(AR,上海凌峰化学试剂有限公司,货号：20200715);SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(碧云天生物科技有限公司,货号：P0015L);过硫酸铵(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,货号：A112450);30%丙烯酰胺(北京索莱宝科技有限公司,货号：A1010);Tris-HCl(南京翼飞雪生物科技有限公司,货号：YT0065,YT1010);TEMED(美国Sigma公司,货号：#STBF7873V);标准蛋白Marker(美国Thermo公司,货号：#26616);PVDF膜(美国Sigma公司,货号：IPVH00010);ECL化学发光液(美国Millipore公司,货号：WBKLS0500);兔源天南星凝集素抗体(金斯瑞生物科技有限公司制备);山羊抗兔IgG二抗(H+L)(南京翼飞雪生物科技有限公司,货号：YFSA02);天南星凝集素蛋白(AEL,实验室自制,电泳纯)。

生品天南星分别购于安徽鑫泰药业有限公司、保和堂(亳州)制药有限公司、四川新荷花中药饮片股份有限公司等企业,经南京中医药大学刘训红教授鉴定为天南星科植物天南星的干燥块茎,各项检查均符合《中国药典》2020年版规定。制天南星均为上述生品按照《中国药典》2020年版炮制方法在实验室自制。样品信息见表1。

表1 天南星样品信息Table 1 Information of Arisaematis Rhizoma samples

2 方法与结果

2.1 制天南星的制备

按照《中国药典》2020年版规定[6],取净天南星,按大小分别用水浸泡,每日换水2～3次,如起白沫时,换水后加白矾(每100 kg天南星,加白矾2 kg),泡1 d后,再进行换水,至切开口尝微有麻舌感时取出。将生姜片、白矾粉置锅内加适量水煮沸后,倒入天南星共煮至无干心时取出,除去姜片,晾至四至六成干,切薄片,干燥。每100 kg天南星,用生姜、白矾各12.5 kg。

2.2 草酸钙含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱为Megres C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为0.5%H3PO4水溶液,柱温25 ℃,流速0.8 mL·min-1,检测波长220 nm,进样量10 μL。色谱图见图1。

注：A.草酸对照品;B.天南星;C.制天南星图1 对照品及天南星生制品HPLC图Fig.1 HPLC of reference substance and raw Arisaematis Rhizoma

2.2.2 供试品溶液的制备 取生天南星和制天南星饮片粉末(过4号筛)约0.5 g,精密称定,置10 mL离心管中,加入5 mL纯水摇匀,置60 ℃水浴20 min,离心,弃上清,重复上述操作1次。残渣加盐酸(体积比1∶1)溶液1 mL,加纯水5 mL,置70 ℃水浴30 min,离心取上清液,定容至10 mL,即得。

2.2.3 对照品溶液的配制 取草酸对照品适量,精密称定,置10 mL容量瓶中,加水定容至刻度,制得1 mL含2 mg的对照品溶液。

2.2.4 线性关系考察 将“2.2.3”项下草酸对照品溶液逐级稀释,制得浓度为0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg·mL-1的对照品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件进行测定。以峰面积为纵坐标(Y),对照品含量为横坐标(X),绘制标准曲线并进行线性回归,回归方程Y=2 799 996.27X-191 224.79,相关系数0.999 5,表明草酸在0.1～2.0 mg·mL-1范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液,连续进样6次,每次进样10 μL,测定峰面积,RSD为0.38%,表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验 取同一批样品粉末,按照“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液,所得供试品溶液分别进样10 μL,测定峰面积,RSD为0.65%,表明该方法重复性较好。

2.2.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液,分别于0、2、6、12、24、48、72 h进样10 μL,测定峰面积,RSD为2.33%,表明供试品溶液在72 h内基本稳定。

2.2.8 加样回收试验 精密称取已测定含量的样品粉末6份，各约0.25 g,按照2.3项下方法制备供试品溶液,在加入1 mL盐酸时,分别加入适量草酸对照品。取供试品溶液10 μL进样,测定峰面积,计算加样回收率。见表2。

表2 加样回收率测定(n=6)Table 2 Results of recovery test(n=6)

2.2.9 样品含量测定 取各批次炮制前后的天南星样品按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,进样量10 μL,测定草酸峰面积,计算草酸含量并转换为草酸钙的含量,各批次生天南星中草酸钙最高含量为2.33%,最低含量为0.78%,平均含量为1.43%;各批次制天南星中草酸钙最高含量为0.98%,最低含量0.29%,平均含量0.60%;草酸钙含量的降幅为25.6%～78.3%,表明炮制后天南星中毒性物质草酸钙的含量显著下降。见表3。

表3 天南星中草酸钙含量(n=2)Table 3 Content of calcium oxalate in Arisaematis Rhizoma (n=2)

2.3 凝集素蛋白检测

2.3.1 对照品溶液制备 取天南星凝集素(AEL),加水配制成初始浓度20 μg·mL-1,并逐级稀释,得到浓度分别为13.33、8.89、5.93、3.95 μg·mL-1的样品,分别加入凝胶电泳上样缓冲液,于100 ℃水浴10 min,即得系列浓度的天南星凝集素蛋白对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液制备 取生天南星和制天南星粉末(过4号筛)1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加水100 mL,称定质量,振摇2 h,再称定质量,用水补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液与凝胶电泳上样缓冲液按4∶1体积比混匀,置水浴中加热5 min,冷却至室温,得到供试品溶液。

2.3.3 Western blot法测定 取上述对照品溶液及供试品溶液均上样5 μL,分离胶的浓度为15%,浓缩胶的浓度为5%，进行电泳(100 V,2 h)。电泳完成后采用湿转法将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上(恒压100 V,45 min),置5%BSA溶液中封闭2 h,TBST溶液洗涤膜5次,每次10 min,加入兔源天南星凝集素的抗血清(稀释倍数1∶1 000),于4 ℃孵育过夜。回收抗血清,将膜用TBST溶液洗涤5次,每次10 min,加山羊抗兔抗体,室温孵育2 h。回收抗体,膜用TBST溶液洗涤5次。化学发光液按比例配制,吸取适量覆盖膜表面约1 min,凝胶成像系统拍摄。图2结果表明,经过炮制,天南星均检测不到凝集素蛋白条带。

2.3.4 Western blot法测定结果 对32批天南星炮制前后凝集素蛋白进行检测,结果表明生天南星经过炮制,未检测到相应条带。以44.5 ng天南星凝集素蛋白灰度值为参照,计算其它各样品相对含量。具体结果见图2。

注:与生品相比,图2 天南星凝集素蛋白检测结果Fig.2 Lectin protein detection in Arisaematis Rhizoma

3 讨论

课题组前期大量研究结果表明,天南星的刺激性毒性是由其所含特殊晶型的针晶复合物引起,且该针晶复合物是由草酸钙针晶及凝集素蛋白共同构成。本研究对天南星炮制前后草酸钙针晶及凝集素蛋白进行测定。结果表明,经过炮制的天南星中草酸钙针晶含量显著降低,凝集素蛋白未检测到条带。课题组前期研究成果表明，炮制过程中白矾及加热等因素可使凝集素蛋白变性和降解,使草酸钙针晶分解破坏,从而使凝集素蛋白及草酸钙针晶含量降低[7-9],本研究进一步证明了毒性成分草酸钙针晶及凝集素蛋白含量的降低是天南星炮制解毒的机制之一。本文针晶的检测方法是以不溶性草酸钙含量作为指标。

HPLC结果显示,生天南星草酸钙含量最高为2.33%,最低为0.78%,平均含量为1.43%,说明不同产地不同批次天南星草酸钙含量存在较大差异。制天南星草酸钙含量最高为0.98%,最低为0.29%,平均含量为0.60%。炮制后草酸钙含量最高降幅78.3%,最低降幅25.6%,平均降幅为55.4%。结果可见,即使炮制降低了草酸钙的含量,但由于某些批次生品中本身草酸钙含量高,炮制后仍然有较高含量,这与炮制后粉末中仍然可见草酸钙针晶但针晶结构发生溶蚀的结果一致[10]。不同批次炮制后草酸钙含量降幅差异较大,也是由不同批次生品天南星的草酸钙含量差异大导致,如生品草酸钙含量相对较高者一般炮制后降幅较高;此外,《中国药典》中关于炮制工艺的控制仅有“口尝微有麻舌感”“内无干心”等主观经验性评价,加之大小个头不均导致各批次间炮制程度略有差异也有关系。但从结果可见,炮制后草酸钙含量显著降低。Western blot结果表明,生天南星经过炮制均未检测到凝集素蛋白条带。提示生天南星经过炮制后,内源性毒性成分草酸钙针晶和凝集素蛋白含量均显著降低。

本研究通过多批次天南星样品炮制前后毒性物质含量变化测定,总结了内源性毒性物质含量变化规律。建立的天南星草酸钙含量测定方法及凝集素蛋白检测方法简便可行,可用于天南星毒性控制。以草酸钙的含量作为毒性控制指标,适用于原料来源稳定(产地、生长年限稳定)样品的质量控制。综合本文研究结果,以凝集素蛋白限度作为天南星毒性控制指标更为稳定可靠,建议制天南星不得检出凝集素蛋白。本文的研究也为后续ELISA试剂盒的开发提供依据。