外源乙烯利对禾谷炭疽菌生物学特性的影响及转BtACO基因植物的抗病性评价

杨利艳 郭晓娣 张玉荣 边 璐 刘金香

(1.山西师范大学 生命科学学院，太原 030031；2.西南大学 柑桔研究所，重庆 400712)

玉米是世界粮食产量最高的作物，随着我国米种植面积的增长，玉米已成为第一大粮食作物[1]。禾谷炭疽菌(Colletotrichumgraminicola) 属于半知菌亚门，是炭疽菌属重要的病原菌，其所引起的炭疽病是玉米最常见的病害之一[2]。禾谷炭疽菌不仅侵染玉米，同时也会侵染其他作物，是危害世界农业生产的重要病害[3]。提高作物对禾谷炭疽菌的抗性对保障作物产量和品质意义重大。大刍草Balsas teosinte (Zeamaysssp.parviglumis) 为禾本科、玉蜀黍属一年生草本植物，是现代栽培玉米最直接的野生近缘种[4]，原产于中美洲和墨西哥一带[5]。在以产量为主要目标性状的长期驯化过程中，玉米品种丢失了很多优良性状，大刍草与玉米相比，具有更强的抗病虫害特性[6-7]。

乙烯是一种植物激素，在植物抵御病害侵染中发挥重要作用[8]。1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase, ACO)是乙烯生物合成途径中的关键酶之一，催化1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid, ACC)到乙烯的生物合成[9]。在转ACO基因的植株中，ACO酶活性以及乙烯释放速率均提高[10-11]。当植物在受到灰霉菌侵染时，乙烯释放量增加[12]。对拟南芥乙烯信号路径缺失突变体(ein2-1、ein4-1、ein6-1、esa1-1和pad1-1)接种黄萎病菌后，发现突变体感病性增强[13]。在水稻中发现乙烯可以促进植物抗毒素的积累以及活性氧的生成，增强水稻对稻瘟病的抗性[14]。以上研究表明，乙烯参与了植物对病害的防御响应。

系统的构建起源于四个方面的需求。1、资源管理的需要。读者利用资源的同时产生了大量的行为数据，这些行为数据的价值在不断递增且有些已经与资源本身的价值等同；2、资源保障的需要。学校乃至教育部对文献资源有学科保障的要求，同时，保障率的分析需要对比整个行业、同类型学校，以及运用类似ESI指标对标全球，即实现行业保障与区域保障；3、绩效评估的需要。图书馆文献资源的绩效评价离不开对其用户行为数据的分析，其中存在着引文的学术规范的问题；4、服务整合的需要。新的服务需要按学科重新整合资源，构建基于云的服务体系。

本课题组前期从大刍草中克隆了乙烯合成途径的关键酶基因BtACO，并获得了转BtACO基因拟南芥。目前乙烯及ACO基因对禾谷炭疽菌致病性的研究鲜有报道。因此，为明确乙烯对禾谷炭疽菌致病性的影响并评价转BtACO基因拟南芥对禾谷炭疽菌的抗性，本研究以禾谷炭疽菌为研究对象，分析和比较不同浓度外源乙烯利对禾谷炭疽菌生长状况的影响，并通过对喷施不同浓度乙烯利处理的拟南芥接种禾谷炭疽菌，调查禾谷炭疽菌的致病性，并对转BtACO基因拟南芥的抗病性进行评价，以期为减轻作物炭疽病提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株为禾谷炭疽菌 (C.graminicola)，由吉林大学张世宏老师惠赠。

供试植物材料有：野生型哥伦比亚型拟南芥种子(Arabidopsisthaliana，Columbia-0)为本实验室保存；转BtACO基因拟南芥植株为T3代纯合体。BtACO基因从大刍草Balsas teosinte中克隆获得，该基因是在对大刍草响应粘虫取食转录组[15]分析基础上筛选，取大刍草叶片进行3′RACE获得该基因的CDS序列，其长度为1 071 bp,提交GenBank获得Accession Number: MK600519。构建植物表达载体并采用农杆菌介导法转化野生型拟南芥，在含有潮霉素的MS培养基上进行筛选获得阳性植株，连续自交，获得T3代纯合体。

马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)培养基成分为马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉18 g，用去离子水定容至1 000 mL[16]。羧甲基纤维素钠(Carboxymethylcellulose sodium，CMC)培养基成分为羧甲基纤维素钠15 g，磷酸二氢钾1.0 g，硝酸铵1.0 g，七水硫酸镁0.5 g，酵母浸膏粉1.0 g，用去离子水定容至1 000 mL[17]。

乙烯利(Ethephon)购自北京索莱宝科技有限公司；氨苄青霉素(Ampicillin sodium salt)购自合肥博美生物科技有限责任公司。

1.2 禾谷炭疽菌孢子悬浮液制备

活体植株接菌观察及生物量测定：将浓度为1×105个/mL 孢子悬液5 mL均匀喷洒于生长 30 d 的转BtACO基因拟南芥和野生型植株莲座叶，黑暗条件下培养24 h后，移入光暗周期16 h/8 h(光照/黑暗)，温度22 ℃/18 ℃(光照/黑暗)培养4 d，每组处理3个重复，期间记录植株发病情况。20 d后测定鲜重。将清洗干净的植株在105 ℃下烘30分钟，65 ℃下烘干至恒重，记录干重。

对不同浓度乙烯利处理组孢子产生情况观察表明，在含有50～75 mg/L乙烯利的CMC培养基中，禾谷炭疽菌的产孢量明显低于对照组；125～200 mg/L 乙烯利处理组孢子的产量明显高于对照组(图1(b)，表1)，即高浓度乙烯利促进了禾谷炭疽菌孢子的产生。

1.3 禾谷炭疽菌黑色素及孢子的观察

分别在100 mL CMC液体培养基中加入乙烯利(浓度100 mg/mL)10、25、50、75、100、125、150、175和200 uL，使乙烯利浓度为10、25、50、75、100、125、150、175和200 mg/L，以不加乙烯利为对照，每组处理设置3个生物学重复。在每个CMC培养基中加5 mL孢子悬液(浓度：1×105个/mL)，置于28 ℃，180 r/min，培养20 d，期间观察孢子生长变化。

分别在100 mL PDA培养基中加入乙烯利(浓度100 mg/mL) 10、25、50、75、100、125、150、175和200 uL，使乙烯利浓度分别为10、25、50、75、100、125、150、175和200 mg/L，以不加乙烯利为对照，每组处理设置3个生物学重复。活化禾谷炭疽菌，在28 ℃ PDA培养基上暗培养7～10 d，用打孔器打取菌饼并置于附加不同量乙烯利的培养基中间，将接种后的培养基置于28 ℃，暗培养7 d，记录禾谷炭疽菌黑色素生长情况。

1.4 不同浓度乙烯利处理拟南芥接菌观察

参照张锴等[18]方法，用无菌水将乙烯利分别稀释到10、25、50、75、100、125、150、175和200 mg/L，在培养30 d的野生型拟南芥叶片表面喷洒5 mL以上不同浓度乙烯利溶液，以喷等体积无菌水为对照。将处理后的拟南芥置于光照条件下培养12 h后，暗培养12 h，之后进行接菌处理。将浓度为1×105个/mL 孢子悬液5 mL均匀喷洒于野生型拟南芥叶片表面，避光培养24 h 后，移入光照培养箱培养7 d，光暗周期16 h/8 h(光照/黑暗)，温度22 ℃/18 ℃(光照/黑暗)，每组处理设置3个生物学重复。每天观察植株发病情况，统计发病株数与发病程度，计算植株病情指数。

病情分级标准为[19]：0级，无症状；1级，接种部位失绿；3级，接种部位周围有过敏性坏死反应；5级，叶片腐烂面积50%；7级，叶片腐烂面积50%～75%；9级，叶片全部腐烂。

离体叶片接菌观察：在生长状况基本一致、生长30 d的转BtACO基因拟南芥和野生型植株上分别选7片莲座叶进行接菌。将孢子悬液(1×105个/mL)以每滴10 μL点接，每叶点接2次，置于铺有湿润滤纸的培养皿中，在黑暗条件下保湿培养24 h后，在光暗周期16 h/8 h(光照/黑暗)，温度22 ℃/18 ℃(光照/黑暗)培养4 d，期间保持滤纸湿润，每天记录离体叶片病斑扩展情况。

实验数据均为平均值±SD，差异显著性分析采SPSS 17.0，One-Way ANOVA。

1.5 转BtACO基因拟南芥和野生型植株抗病性比较

病情指数=∑(病级×各级发病叶数)/(最高发病级数×调查叶数)×100。

在PDA培养基中活化禾谷炭疽菌，附加抗生素氨苄青霉素，28 ℃黑暗培养7～10 d，待菌丝长满平板后用打孔器打取菌饼，放置于PDA固体培养基上，光照条件下28 ℃培养3～6 d，至菌丝布满整个平板，用打孔器打菌饼。在50 mL无菌离心管加入20 mL无菌水，每个离心管中加30个菌饼，震荡摇匀，用三层无菌纱布过滤至50 mL无菌三角瓶内(分离除去菌丝体)，滤液即为孢子悬液，使用血球计数板在显微镜下进行计数(孢子浓度为2.6×105个/mL)，在孢子悬液中加入无菌水稀释到1×105个/mL，备用。

1.6 数据处理

1）交叉模式：如果发射器连接交点，则发生交点模式.发射机将计算所有连接路段的权重，并选择最小权重来传输数据包.考虑计算的距离和连通概率，考虑到多层结构的影响，用RAR中的3-D欧几里德距离来定义距离.

证监会认定，龙薇传媒在本次收购前一个月成立，期间未进行资金的充分筹备，在境内可支付资金有限、金融机构拟融入资金缺乏充分准备的情况下，采取高杠杆收购方式，签订股权转让协议。在履行能力、履行结果不确切，收购行为真实性、准确性不能保证的情况下，贸然公布收购信息。其行为因其名人效应等因素叠加，严重误导市场及投资者，引发市场和媒体的高度关注，致使万家文化股价大幅波动，严重扰乱了正常的市场秩序。

2 结果与分析

2.1 外源乙烯利影响禾谷炭疽菌黑色素及孢子的产生

为明确乙烯对禾谷炭疽菌生长的影响，对不同浓度乙烯利处理组黑色素和孢子产生情况进行观察，结果分别见图1和表1。可知：在含有低浓度乙烯利(10～100 mg/L)的PDA培养基上，禾谷炭疽菌菌株黑色素的产量均高于对照组。之后随着乙烯利浓度的升高(125～200 mg/L)，黑色素产量下降，均低于对照组((图1(a)，表1)，但外源乙烯利对禾谷炭疽菌菌丝生长速度无明显影响(表1)。上述结果表明，外源乙烯利会影响禾谷炭疽菌黑色素的产生，低浓度乙烯利起促进作用，高浓度乙烯利则抑制黑色素的产生。

A～J，乙烯利质量浓度分别为0，10，25，50，75，100，125，150，175和200 mg/L。下同。A-J: Ethephon concentrations are 0, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 and 200 mg/L, respectively. The same below.图1 乙烯利对禾谷炭疽菌黑色素(a)和孢子生长(b)的影响Fig.1 Effects of ethephon on melanin (a) and spore production (b) of C.gloeosporioides

东晋初年，李充受命在《晋中经簿》基础上，校对所有藏之书与整理旧籍，编撰成《晋元帝四部书目》。李充对书目分类进行调整，以经书为甲部，史记为乙部，诸子为丙部，诗赋等为丁部，正式确立了四部排列的顺序，是历代沿用的经、史、子、集四部分类体系的雏形。

表1 不同浓度乙烯利处理组菌丝生长状况Table 1 Mycelial growth profile under various concentrations ethephon treatments

2.2 不同浓度乙烯利影响禾谷炭疽菌的致病性

为明确不同浓度乙烯利对禾谷炭疽菌致病性的影响，对活体接菌的野生型拟南芥进行了观察。对照组叶片出现部分黄化，病级多集中在3、5级，病情指数为7.9。当乙烯利浓度为10～75 mg/L时，少数叶片出现黄化现象，病级多集中在0、1、3级，病情指数显著低于对照组及其它高浓度乙烯利处理组(P<0.05)；当乙烯利浓度为100～125 mg/L时，叶片发病程度较为严重，病级多为7、9级，少数为1、3级，病情指数显著高于对照组(P<0.05)；当乙烯利浓度为150～200 mg/L时，叶片发病程度最重，病级多为7、9级，少数为3、5级，病情指数显著高于对照组(P<0.05)(图2)。以上结果表明，低浓度(10～75 mg/L)乙烯利可降低禾谷炭疽菌的致病性，高浓度(125～200 mg/L)乙烯利增强禾谷炭疽菌的致病性。

方玫在上海呆了快一年了，她还没去哪儿玩过，所以很激动。徐东就笑她，然后很自然地接过她手里的包。方玫的脸红了一下，没有拒绝。

2)从花岗岩中实测球面波粒子速度波形的时域和频域分析结果可知，在测点半径约为30 mm(比距离约为60 m·kt-1/3)处，粒子速度峰值的衰减规律出现由慢变快的转折；

不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。下同。Different small letters indicate significantly different at 0.05 level among different treatments. The same below.图2 不同浓度乙烯利对禾谷炭疽菌致病性的影响Fig.2 Pathogenicity of C.graminicola with different concentrations of ethephon

2.3 转BtACO基因拟南芥提高了对禾谷炭疽菌的抗性

为评价BtACO基因对禾谷炭疽菌的抗性，首先，对转BtACO基因拟南芥和野生型植株进行离体叶片接菌，4 d后对叶片发病情况进行了观察。转BtACO基因拟南芥叶片没有形成明显的炭疽斑，黄化现象不明显; 野生型拟南芥叶片炭疽斑面积较大，黄化现象严重 (图3(a))。

4.3 从相关关系角度 挖掘相关关系，摆脱因果思维的局限，是大数据技术最具价值的部分之一，是从无到有的突破。谷歌成功预测2009年全球H1N1流感发生就是典型案例，通过挖掘“治疗咳嗽和发热药物”词条的变化趋势，得出流感在时间和空间上的相互关系，并与美国疾控中心的记录数据进行对比，在甲型H1N1流感暴发几周前，成功预测了流感暴发[11]。

接着进行转BtACO基因拟南芥和野生型植株活体接菌，调查发病情况并进行比较，结果如3(b)：第一天，两组叶片均无明显变化；第二天，野生型植株叶片出现部分黄化现象，病级多集中在1、3级，病情指数为2.4，而转BtACO基因拟南芥仍无变化；接菌第三天，野生型拟南芥发病程度加重，黄化部位增多，病级多集中在3、5级，病情指数为6，转BtACO基因拟南芥少数叶片开始出现部分失绿，病级多集中在1级，病情指数为0.5，较野生型拟南芥病情指数降低91.7%；第四天、第五天野生型拟南芥叶片黄化现象严重，出现较多病斑，病级多集中在5、7、9级，病情指数大幅上升，转BtACO基因拟南芥叶片发病程度较轻，病级多集中在3、5级，少有7级，病情指数显著低于野生型植株(P<0.05)。综上，与野生型材料相比，转BtACO基因拟南芥对禾谷炭疽菌的抗性提高。

禾谷炭疽菌侵染20 d后，转BtACO基因拟南芥的鲜重、干重分别均较野生型植株增加19.5%和6.7%(P<0.05)，即过表达BtACO的转基因拟南芥生物量积累高于野生型(图3(c, d))。综合离体、活体接菌结果可见，BtACO基因可提高植株对禾谷炭疽菌的抗性，最终表现为生物量的增加。

图3 转BtACO拟南芥和野生型植株抗病性及生物量比较Fig.3 Disease resistance and biomass accumulation comparison between BtACO Arabidopsis and wild type plants

3 讨论与结论

已有研究表明乙烯可促进病原菌的生长发育、提高病原菌的致病性[20]; 持续释放乙烯会提高植物对多种真菌的抗性[21]；乙烯对病原菌的发展无明显影响[22-24]。

植物病原菌孢子的数量在病害形成及循坏周期中发挥重要的作用[25-26]。当胶孢炭疽菌分生孢子产量下降时，致病力减弱[27]。本研究也得到相似结果：当乙烯利浓度高于125 mg/L时，产孢量较对照提高，此时植株病情指数明显高于对照，即产孢量与禾谷炭疽菌的致病性具有相对一致性。同时发现，不同浓度乙烯利对孢子的产生有不同的影响：高浓度乙烯利(125～200 mg/L)促进孢子萌发，这与乙烯利对盘长孢状刺盘孢(C.gloeosporioides)和香蕉刺盘孢(C.musae)生长的影响类似[28]，但与张苗等[29]发现的低浓度乙烯利促进链格孢孢子萌发，高浓度起到抑制作用不同，可能是由于病原菌的种类不同，对乙烯利的响应不同，即乙烯利对孢子生长的影响与真菌种类有关。研究表明黑色素的致病作用，可能是通过强化附着胞的形成及与其他毒素复合起作用[30]，而本研究发现黑色素的产量与致病性无明显相关性。转BtACO基因拟南芥比野生型植株对禾谷炭疽菌有更强的抗性，生物量的积累较高。研究表明ACO基因参与了植物对病菌侵染的响应[12-13,31]，根据本研究中结果中乙烯利浓度与禾谷炭疽菌致病性强弱的关系，推测转BtACO基因植株的较高抗病性是由于BtACO基因的表达影响了乙烯的生物合成，可能是转BtACO基因植株提高了释放的乙烯的浓度，但尚未达到使禾谷炭疽菌致病性增强的高浓度。然而，植物的抗病与病原菌的致病是一个非常复杂的相互作用体系，BtACO基因如何在该复杂的体系中发挥功能，仍需进一步研究验证。

综上，低浓度外源乙烯利处理(10～75 mg/L)可降低禾谷炭疽菌的致病性，BtACO基因可以作为抗禾谷炭疽病的候选基因。