羊栖菜醇提物中岩藻黄素的检测*

赵 丽，冯娟娟，张腊梅，朱晴晴

(山东洁晶集团股份有限公司质量管理部，山东 日照 276826)

岩藻黄素(Fucoxanthin)，是存在于褐藻、硅藻、无脊椎海洋动物中的具有含氧多烯烃及共轭结构的脂溶性偏极性类胡萝卜素[1]，其中以全反式结构为主(见图1)。

图1 全反式岩藻黄素结构式

羊栖菜中，岩藻黄素的含量相对较高，有企业已经实现工业规模化生产，但是因岩藻黄素价格较高，市场上冒充品也随即诞生，主要以玉米黄素冒充品较多。目前，岩藻黄素已被国内外科研结果证实，具有多种生理活性[2-6]。2008年前后，国内就有企业开始以褐藻为原料，进行工业化提取岩藻黄素，推出纯度0.5%～5%范围的岩藻黄素产品，主要用于出口。日本、美国等已经对该产品的安全性毒理学评价，并认可[7-8]。美国FDA已批准岩藻黄素作为新食品补充剂，欧洲、日本、韩国均准许并有市场已流通的产品，应用领域以食品、保健品为主导，辅以化妆品领域，也有部分原料来自中国。国内岩藻黄素产品受检测方法、产品标准等方面的限制，用于食品的生产许可方面还是空白，这在很大程度上限制和阻碍了岩藻黄素在国内食品等领域的推广。

利用有机溶剂提取，是目前生产岩藻黄素的主要方法。虽然有研究采用高效液相色谱法(HPLC法)对其含量进行检测[9-11]，但目前市场上的产品，主要采用紫外分光光度计法(UV法)检测含量，存在不能消除产品中以玉米黄素为代表的其他类胡萝卜素混淆岩藻黄素的可能，检测区分度较小。为了区分以玉米黄素为代表的其他类胡萝卜素混淆岩藻黄素的情况，同时也进一步为规范市场提供参考，本研究采用薄层层析与HPLC联合的方法，对羊栖菜醇提物中岩藻黄素进行双重定性和定量分析。先以岩藻黄素标准品对照进行薄层层析鉴别[12]，若确定产品中含岩藻黄素且不含以玉米黄素为代表的其他类胡萝卜素，再进一步进行HPLC法二次定性，同时进行含量检测。本研究不仅可以促进企业合理调整工艺，完善检测手段，为产品性能提供指导依据，而且还可以更好地促进行业技术升级、产业进步，有利于生产和贸易的发展。同时，在提高岩藻黄素产品质量的美誉度以及市场的认可度，促进商品流通和维护公平竞争等方面发挥积极的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

羊栖菜醇提物由山东洁晶集团股份有限公司生产；岩藻黄素标准品(纯度w≥95.0%)购于美国Sigma公司；玉米黄素标准品(纯度w≥85%)购于上海源叶生物科技有限公司；分析纯乙醇、优级纯正己烷、色谱纯乙腈、色谱纯甲醇，购于国药集团化学试剂有限公司；分析纯丙酮，购于烟台远东精细化工有限公司；实验用水为自制超纯水。

1.2 仪器设备

SB-800DTD超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；AR124CN电子天平(奥豪斯仪器上海有限公司)；P-I型薄层色谱展开缸(上海信谊仪器厂有限公司)；硅胶G薄层板(青岛胜海精细硅胶化工有限公司)；高效液相色谱仪(配二极管阵列检测器)(美国Waters公司)；C18色谱柱(φ4.6 mm×150 mm，5 μm)(美国Waters公司)；Exceed-Cc-100艾柯实验室超纯水机(成都艾柯水处理设备有限公司)

1.3 实验方法

1.3.1 岩藻黄素的薄层色谱鉴定

1)标准品及样品溶液的配制

取岩藻黄素标准品、玉米黄素标准品各 1 mg，分别加入试管中并加入适量乙醇；超声使之完全溶解，分别转移至 5 mL 容量瓶中；加乙醇配制成质量浓度为 1 mg/mL 的溶液，避光保存。取试样 0.1 g，于试管中，加入适量乙醇，超声使之完全溶解，转移至 5 mL 容量瓶中定容，避光保存。

2)薄层色谱操作

分别吸取对照品溶液、试样溶液各 5 μL，点样于硅胶G薄层板上。将点好的薄层板放入展开缸中，进入展开剂的深度为距原点 5 mm 为宜，密闭。在正己烷-丙酮(体积比6.5∶3.5)展开剂中，展开距离约 8 cm，取出薄层板，标记展开剂前沿位置，晾干后检测。整个实验过程要求在 1 h 内完成。

3)薄层色谱结果判定

置可见光下检视，与岩藻黄素标准品进行对照，试样色谱相应的位置上显示相同颜色的斑点，呈黄色或黄棕色。与玉米黄素标准品对照色谱相应的位置上无斑点。按照中国药典中的薄层色谱方法[13]计算比移值Rf，且试样比移值和岩藻黄素标准品比移值相差范围应在3%以内。

1.3.2 岩藻黄素含量的高效液相色谱法检测

1)标准品及样品溶液的配制

将岩藻黄素标准储备溶液用乙腈逐级稀释，配制成质量浓度为0.0、0.1、0.2、0.5、2.0、5.0、10.0 mg/L 的岩藻黄素标准溶液。分别取上述溶液经滤膜过滤至液相瓶中待测。

根据样品目标含量的不同，准确称取待测样 0.02～0.06 g(精确至 0.0001 g)，加入少量乙醇，放入超声波清洗仪中超声 5 min 使其溶解充分，样品用乙醇定容至 100 mL 棕色容量瓶中，超声脱气、经滤膜过滤至液相进样瓶中待测。

2) 高效液相色谱条件

色谱柱：C18色谱柱，φ4.6 mm×150 mm，5 μm；柱温：25 ℃；流速：0.8 mL/min；流动相：溶剂A：乙腈(80%)；溶剂B：纯水(20%)；紫外检测器：波长 450 nm；进样体积：10 μL；外标法定量。

2 结果与分析

2.1 羊栖菜醇提物中岩藻黄素的薄层色谱鉴定

经过多次试验验证：岩藻黄素Rf值范围在0.40～0.49之间，而玉米黄素Rf值大于0.5。玉米黄素的比移值相对于岩藻黄素标准品及样品偏高，能够明显区分开来，如图2。图2中，自左到右分别为：玉米黄素标准品、岩藻黄素标准品、羊栖菜醇提物样品、羊栖菜醇提物样品平行。样品比移值和岩藻黄素标准品比移值相差范围均在2%～3%之间。

1.玉米黄素标准品；2.岩藻黄素标准品；3.羊栖菜醇提取物；4.羊栖菜醇提物。图2 玉米黄素、岩藻黄素标品及样品薄层色谱日光图

2.2 羊栖菜醇提物中岩藻黄素的HPLC检测

2.2.1 方法线性范围

将岩藻黄素标准储备溶液使用乙腈逐级稀释，配制成质量浓度为 0.0、0.1、0.2、0.5、2.0、5.0、10.0 mg/L 的标准系列工作溶液，上机测定，在此范围内岩藻黄素标准溶液质量浓度与响应值呈线性相关，线性方程为y=195.25x+4.1548，相关系数为0.9998，线性回归曲线见图3。由图3知，在实验质量浓度范围内，质量浓度与峰面积线性关系良好。岩藻黄素系列标准溶液色谱图见图4。

图3 岩藻黄素浓度与峰面积的线性回归关系 图4 岩藻黄素对照品色谱图

2.2.2 检出限、定量限

检出限：将岩藻黄素标准溶液稀释至3倍信噪比附近，重复验证6次，得出仪器3倍信噪比所对应的检出限质量浓度为 0.025 mg/L。定量限：将提取后的样品待测液稀释至低质量浓度水平，使该质量浓度水平信噪比接近10，重复验证6次，得出褐藻油样品定量限为 20 mg/kg，褐藻粉末样品定量限为 200 mg/kg。

2.2.3 样品测定

羊栖菜醇提物6次平行样品中岩藻黄素含量测定结果平均为 531 mg/kg，精密度相对标准偏差为1.1%，6次平行样品中岩藻黄素质量分数结果见表1，色谱图见图5。在 11.4 min 左右出目标峰，表明方法的专属性良好。

表1 样品岩藻黄素测定结果

图5 样品色谱图

2.2.4 加标回收率

样品定量限以及样品含量选择三个加标水平分别为100、200 和 400 mg/kg，每个加标水平做6次平行测试，加标回收率结果见表2。加标水平在 100～400 mg/kg 范围内时，回收率在97.5%～99.3%。

表2 样品回收率实验检测结果

3 结论

本文采用薄层色谱和高效液相色谱联合的方法，对羊栖菜醇提物中岩藻黄素进行了双重定性和定量分析。首先定性检测，确保产品中不含以玉米黄素为代表的其他类胡萝卜素；定性确认后，再经过高效液相色谱法进行定量检测。定量操作准确、回收率高、重复性好，为评价实验室提取的以及企业生产的羊栖菜醇提物的质量以及规范市场提供依据。本文也可作为其他原料所提取的岩藻黄素及其加工产品中岩藻黄素含量的定性、定量检测提供参考。