高效液相色谱法测定黄瓜中双炔酰菌胺残留量

◎ 黎 东，张周莉，雍 萍，廖 兰，易 达

（南充市食品药品检验所，四川 南充 637000）

随着国内外社会经济逐渐发展，食品安全备受人们关注，农药残留已为食品安全问题的关注焦点之一。农药在防虫、防害、保护及促进农作物生长的同时伴随着超量使用甚至滥用，造成的农药残留量超标问题对人们的生活环境和身体健康造成严重的威胁。据统计，我国2020年农药行业规模以上企业化学农药原药（100%）产量为225.4万t，国内农药使用量为145.6万t，已跃居全球最大的农药生产使用国。世界卫生组织统计，每年全球由于农药残留受到健康影响人数约为300万人，其中中毒致死人数约为30万人，农药残留产生的食品安全问题频频发生[1]。

双炔酰菌胺杀菌剂是近几年国外公司开发的一种新型羧酸酰胺类卵菌病毒杀菌剂，针对黄瓜霜霉菌、葡萄霜霉病、辣椒疫霉病、马铃薯晚疫病和番茄晚疫病等靠气流传播、潜伏期长、发病迅猛、浸染速度快的病菌具有无交互抗性、效果好、活性高、持效期长、杀菌谱广的特点[2]。近几年市场成长性非常好，2009—2014年复合年增长率为58.5%。随着双炔酰菌胺的大量使用，双炔酰菌胺农药残留逐渐引起人们关注，国外发达国家及我国标准和法规对该类农药制定了最高残留限量。我国最新颁布的食品安全国家标准GB 2763—2021规定了黄瓜中双炔酰菌胺残留量，但未推荐相应的检测方法[3]。目前报道的果蔬中双炔酰菌胺检测方法主要为液质法，具有设备昂贵、操作难度大、人员要求高等缺点，蔬菜中双炔酰菌胺高效液相色谱检测方法亦未见报道[4-5]。

本文采用乙腈提取样品，分散固相萃取净化提取液，高效液相色谱法为检测方法，建立了黄瓜中双炔酰菌胺残留量的定性及定量分析方法，该方法具有操作简便快捷、准确度高、稳定性好等特点，可以作为双炔酰菌胺定性及定量检测的参考方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标准品：双炔酰菌胺，纯度99.28%，德国Dr.E；乙腈，色谱纯，诺尔施；无水硫酸镁，成都科隆，分析纯；氯化钠，分析纯，成都科隆；柠檬酸钠二水合物（C6H5Na3O7·2H2O），分析纯，国药集团；柠檬酸二钠盐倍半水合物（C6H5Na3O7·1.5H2O），分析纯，国药集团；乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（PSA），粒径：40～60 μm，逗点生物；十八烷基硅烷键合硅胶（C18），粒径：40～60 μm，逗点生物；石墨化炭黑（GCB），40～120 μm，逗点生物；陶瓷均质子，2 cm（长）×1 cm（外径），逗点生物；微孔滤膜，13 mm×0.45 μm，津腾。

1.2 仪器与设备

DIONEX UHPLC+Ultimate 3000型高效液相色谱仪，美国Thermo公司；Multi-Reax型涡旋振荡器，德国heidolph；5810R型冷冻离心机，德国eppendorf公司；KQ-700DE型超声仪，昆山市超声仪器有限公司；N1-50型氮吹浓缩仪，上海屹尧仪器科技发展有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

称取适量（精确至0.000 1 g）的双炔酰菌胺标准物质，用乙腈溶解配制浓度为290 0 μg·mL-1左右的标准储备液，保存于-18 ℃冰箱内。进行试验时，以50%乙腈水溶液作为稀释剂，用标准储备液配制出浓度分别为 0 μg·mL-1、2.90 μg·mL-1、7.25 μg·mL-1、14.50 μg·mL-1、29.00 μg·mL-1、58.00 μg·mL-1、116.00 μg·mL-1、174.00 μg·mL-1、232.00 μg·mL-1和290.00 μg·mL-1的溶剂标准工作液。

1.3.2 试样采集及制备

在农贸市场随机采集黄瓜样品3份，每份1 kg，将采集后的样品切碎，充分混匀，四分法取一部分后用组织捣碎机匀浆，放入聚乙烯瓶中，于18 ℃条件下保存。

1.3.3 样品前处理步骤

称取约10 g（精确至0.01 g）试样于50 mL塑料离心管中，加入10 mL乙腈，高速匀浆3 min，加入4 g无水硫酸镁，1 g氯化钠，1 g柠檬酸钠二水化合物，0.5 g柠檬酸二钠盐倍半水化合物，剧烈振荡1 min，4 200 r·min-1离心5 min。定量吸取5 mL上清液至内含除水剂和净化材料的塑料离心管中（每毫升提取液使用150 mg无水硫酸镁、25 mg PSA、2.5 mg GCB），涡旋混匀1 min。4 000 r·min-1离心5 min，吸取上清液过0.45 μm有机微孔滤膜，待测定。

1.3.4 液相色谱仪器条件

色谱柱：中谱红RD-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；流动相：流动相A为水，流动相B为乙腈，A∶B=50∶50；检测波长：223 nm。

2 结果与分析

2.1 色谱条件选择

通过DIONEX UHPLC+Ultimate 3000型高效液相色谱仪二极管阵列检测器紫外波长全扫描功能，获得双炔酰菌胺的紫外全波长扫描图1，从图中可以看到双炔酰菌胺紫外最大吸收波长在195 nm及223 nm附近，波长195 nm附近具有较大的溶剂干扰，将检测波长定为223 nm可保障双炔酰菌胺具有较大吸收峰同时基质干扰较轻。色谱柱对比了中谱红RD-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm） 和 Ailent Eclipse Plus C8（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）2种色谱柱的分离效果和仪器响应。结果表明，双炔酰菌胺在中谱红RD-C18柱子上具有较好的峰形和重现性，双炔酰菌胺标准品色谱图见图2，而Ailent Eclipse Plus C8分离度低，出峰时间过快。因此本实验最终选择中谱红RD-C18分离待测物质。双炔酰菌胺化学性质为弱极性，用乙腈作为溶剂溶解样品，并选择乙腈和水作为流动相，为得到更好的分离效果和峰形，将流动相按不同比例在色谱柱上进行试验，最终确定流动相为乙腈∶水=50∶50，在流速1.0 mL·min-1时，对双炔酰菌胺目标物质及杂质能够进行很好的分离，具有分离度高、峰形对称因子高、基线平稳及分析时间短等特点，提高了工作效率。

图1 双炔酰菌胺的紫外全波长扫描图

图2 双炔酰菌胺标准品色谱图

2.2 样品提取及净化

本实验以乙腈作为样品提取溶剂，比较了匀浆3 min、陶瓷均质子振荡5 min及超声20 min 3种样品溶液提取方式，确定匀浆3 min加标样品可得到较高的回收率。利用便捷快速前处理方法对样品进行提取，在均质机中将提取剂和样品充分匀浆后，再加入硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠二水合物、柠檬酸二钠盐倍半水合物，提取时加入硫酸镁脱除样品溶液中的水分。加入氯化钠、柠檬酸钠二水合物、柠檬酸二钠盐倍半水合物可以通过盐析作用提升提取效率，实验表明该方法可较好地将样品中双却菌酰胺提取完全。QuEChERS法检测农残的前处理过程中应用广泛，实验关键点在于选择分散固相萃取材料的品种和用量。通过考察GCB、C18、PSA 3种种常见的基质分散萃取材料，实验表明，GCB净化效果最明显，但是对双炔酰菌胺也会有一定程度的吸附，导致回收率较低，而PSA和C18对药物的吸附不显著，同时也有足够的净化能力，PSA对蔬菜水果样品基质净化能力高于C18，最后选择以PSA为主以GCB为辅作为萃取净化试剂。使用不同用量的PSA和GCB处理提取液，最后确定净化每毫升提取液时，以25 mg PSA、2.5 mg GCB作为萃取净化试剂比较合适。

2.3 方法线性关系、线性范围及检出限

将配制的标准系列工作溶液在上述色谱操作条件下进行分析，以双炔酰菌胺标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，检测方法线性方程式为Y=0.452 0X+0.321 3、相关系数R2为0.999 9，线性范围为 0.145 ～ 290.0 μg·mL-1。在样品中按照 7.25 mg·kg-1浓度加标，根据建立的检测方法测得结果，检出限LOD以信噪比3倍进行计算，定量限以信噪比10倍进行计算，得到马铃薯中3种农药检出限为0.01 mg·kg-1及定量限为0.03 mg·kg-1.

2.4 方法回收率和精密度

准确称取10.0 g阴性黄瓜于50 mL离心管中，分别添加一定量的双炔酰菌胺标准溶液，使添加浓度 水 平 为 0.03 mg·kg-1、0.30 mg·kg-1、5.80 mg·kg-1、29.00 mg·kg-1于冰箱中冷藏过夜后按所建立方法处理测定。每个添加浓度重复6次，计算回收率和精密度，结果见表1。由表1可见，在0.03～29.00 mg·kg-1范围内，黄瓜中双炔酰菌胺添加的回收率为82.5%～94.5%；相对标准偏差在0.64%～4.80%，方法具有良好的准确度和精密度。

表1 方法回收率和精密度测定结果表（n=6）

3 结论

本研究建立了高效液相色谱法测定黄瓜中双炔酰菌胺杀菌剂残留量的分析方法，该方法采用QuEChERS法进行样品溶液提取，使用分散固相萃取法进行净化，本方法的准确度和精密度高，线性关系良好，具有简便、快速、准确及分离效果好的优点，为双炔酰菌胺可行性分析方法。