Box-Behnken响应面法优化小桐子枝叶中生物碱提取工艺

◎ 林 巧，江文世，李瑶佳，何劭英

（1.西昌学院，四川 西昌 615000；2.攀西特色作物研究与利用四川省重点实验室，四川 西昌 615000）

小桐子（Jatropha curcasL.），别名麻疯树，是大戟科麻疯树属落叶丛生小树木。人们最开始是在美洲热带地区发现小桐子这种植物，目前小桐子在中国西南部有大量人工栽培种植或半野生种[1]。此植物种仁含油量最高值为61.5%，是一种十分理想的热带地区生物柴油原料植物，小桐子目前已被大面积种植于云南、四川、贵州等地。小桐子不仅是世界上古老的药用植物，还是有毒植物，但其全株均可入药[2-3]。目前，学术界对小桐子的研究集中在从小桐子枝叶中提取、分离、鉴定得到具有抑菌活性的毒蛋白curcin和β-1,3-葡聚糖酶（β1,3-glucanase），并对其活性及作用机理等方面进行了研究，但对小桐子中生物碱以及小桐子果壳中的抗菌活性的研究少有报道[4]。本文通过对小桐子果壳中物质进行分离并研究了小桐子枝叶中生物碱的最佳提取工艺，以期为使用小桐子果壳研制抗菌药物提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

项目组分别于2019年和2020年多次前往会理县采集小桐子叶片样品，经鉴定为麻疯树的干燥带枝叶，共采集样品约20 kg。样品经过清洗、晾晒、烘干和粉碎过60目筛，得到干燥粉末样品约5 kg。

1.2 仪器与设备

试验中用到的仪器与设备相关信息如表1所示。

表1 仪器与设备信息表

1.3 试验方法

1.3.1 待分离样品的制备

按一定料液比加入小桐子叶样品粉末和一定体积分数的提取溶剂，用1%的盐酸溶液定容，调节pH值。在一定温度下超声提取一定时间过滤，旋转蒸发浓缩，二氯乙烷萃取分离，分离得到的水相中加入pH=10的10%的碳酸钠溶液碱化，二氯乙烷萃取分离，将得到的有机相置于烘箱烘干得到生物碱的粗提物。

1.3.2 单因素优化试验

研究不同提取溶剂、超声温度、超声时间、溶剂体积分数、料液比和盐酸pH值对小桐子生物碱提取率的影响。

（1）控制pH=2，超声温度40 ℃，超声时间30 min，料液比1∶30（g·mL-1），分别采用甲醇、乙醇（体积分数80%）和丙酮、1%HCl-水和10%碳酸钠-水提取小桐子中的生物碱。

（2）控制pH=2，设置超声时间为30 min，乙醇体积分数80%，料液比1∶30（g·mL-1），在超声温度为30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃的温度条件下进行单因素试验。

（3）控制pH=2，超声温度40 ℃，乙醇体积分数80%，料液比1∶30（g·mL-1），在超声时间为10 min、20 min、30 min、40 min和50 min的条件下进行单因素试验。

（4）控制pH=2，超声时间、超声温度、乙醇体积分数分别设置为30 min，40 ℃，80%，在料液比（g·mL-1）分别为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60时，进行单因素试验。

（5）控制pH=2，超声时间50 min，超声温度40 ℃，料液比1∶30（g·mL-1），在乙醇体积分数为50%、60%、70%、80%和90%的条件下进行单因素试验。

（6）控制超声时间30 min，超声温度40℃，乙醇体积分数80%，料液比1∶30（g·mL-1），在盐酸pH值为1、2、3、4和5的条件下进行单因素试验。

1.3.3 响应面试验设计

以生物碱总含量Y为响应值，以提取溶剂的体积分数A、超声时间B、超声温度C这3个不同的因素为自变量，并且将每个自变量都设置成低、中、高3个水平[5]，利用Design-Expert8.0.6软件，采用Box-Behnken对小桐子枝叶生物碱超声提取工艺进行3因素3水平的研究[6]，因素水平见表2。

表2 Box-Behnken试验因素水平表

1.3.4 标准曲线绘制

将盐酸川芎嗪对照品称取0.018 0 g放入规格为25 mL的容量瓶中。接着向容量瓶中添加氯仿溶解盐酸川芎嗪对照品，并迅速稀释至刻度线。如上操作后可得浓度为0.720 mg·mL-1的盐酸川芎嗪对照品溶液。准确量取0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL和2.5 mL上述方法配制的盐酸川芎嗪对照品溶液，先分别装于规格为60 mL的分液漏斗中，然后再向其中加入7 mL溴甲酚绿缓冲液，并向其中加入氯仿至溶液体积达到10 mL。按以上方法完成显色，分取氯仿层，参比为空白溶液，于420 nm处测定吸光度。横坐标为盐酸川芎嗪对照品质量浓度（mg·mL-1），纵坐标为吸光度，由此可以进行线性拟合，从而绘制标准曲线[7]。

1.3.5 提取物中生物碱含量测定

取小桐子生物碱的粗提物2 mL，放置于规格为60 mL分液漏斗中，接着向漏斗中加入溴甲酚绿缓冲液7 mL，并向其中加入氯仿至溶液体积达到10 mL，按以上方法完成显色，分取氯仿层，参比为空白溶液，于420 nm处测定吸光度。按照以下的公式计算生物碱提取率。

式中：m1为小桐子生物碱质量，g；m2为小桐子粉末质量，g。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂对小桐子枝叶中生物碱提取率的影响

由表3可知，在以下5种不同的提取溶剂中，采用乙醇作为提取溶剂时，小桐子生物碱提取率最高。这可能是因为小桐子生物碱是属于亲脂性的仲胺或叔胺生物碱，易溶于极性较小的有机溶剂中。

表3 不同溶剂对小桐子生物碱提取率的影响表

2.2 不同超声温度对生物碱提取率的影响

由图1可知，随着超声温度的增加，小桐子生物碱提取率先增加后降低。当超声温度为40 ℃时，生物碱提取率最高；当超声提取温度＞40 ℃时，小桐子生物碱提取率不断下降。这是因为温度过高，提取溶剂乙醇挥发，生物碱在溶剂中的溶解率下降，生物碱提取率降低。因此，选择超声提取温度为30 ℃、40 ℃和50 ℃进行响应面优化试验。

图1 超声温度对生物碱提取率的影响图

2.3 不同超声时间对小桐子枝叶中生物碱提取率的影响

由图2可知，在一定的范围中，小桐子枝叶中生物碱提取率随着不同超声时间的增加而呈现增加状况，当超声所用时间超过20 min后，随着超声时间的增加，生物碱的提取率却逐渐下降，这可能是由于超声时间的增加破坏了生物碱的内部结构，同时使提取溶剂挥发了一部分，导致生物碱提取率下降。因此，选择超声提取时间为10 min、20 min和30 min进行响应面优化试验。

图2 超声时间对生物碱提取率的影响图

2.4 不同乙醇体积分数对小桐子枝叶中生物碱提取率的影响

由图3可知，在一定范围中，小桐子枝叶中生物碱提取率随着乙醇体积分数的增加呈现逐渐增加的状态。当乙醇的体积分数达到80%时，生物碱的提取率达到最高值，继续增加乙醇的体积分数，生物碱继而提取率下降。因此，本试验选择乙醇的体积分数为70%、80%和90%进行响应面优化试验。

图3 乙醇体积分数对生物碱提取率的影响图

2.5 不同料液比对小桐子生物碱提取率的影响

由图4可知，在一定范围内，小桐子生物碱提取率会随着料液比的增加而呈现逐渐增大的状态，料液比超过1∶30（g·mL-1）后，生物碱提取率逐渐下降。这是因为在一定范围内，增加料液比有助于增大提取溶剂与浸提物的接触面积，提取率增加。但是料液比过大，不利于小桐子生物碱的溶出，生物碱提取率降低。

图4 料液比对生物碱提取率的影响图

2.6 不同盐酸pH值对小桐子生物碱提取率的影响

由图5可知，在一定范围内，随着pH值增加，生物碱的提取率不断降低。这是因为生物碱与酸反应形成可溶于水的物质被萃取出来。因此，选择最佳盐酸pH值为1。

图5 pH值对生物碱提取率的影响图

2.7 响应面试验

Box-Behnken试验设计与结果见表4。利用Design-Expert 8.0.6响应面试验设计软件对表4中的试验结果进行分析拟合后得到的二次多项回归方程为Y=0.61-8.25×10-3A+4.75×10-3B+3×10-3C-5×10-4AB+2×10-3AC+1×10-2BC-0.045A2-0.021B2-0.025C2（R2=0.878 9），该数据说明该模型的拟合度比较适宜，试验所得误差值比较小。

表4 Box－Behnken设计与结果表

2.7.1 方差分析与显著性检验

对方程进一步进行方差分析，结果见表5。由表5可知，模型P=0.016 3＜0.05，说明本次试验回归模型中的自变量与因变量这两个变量的回归关系显著，失拟项P=0.46＞0.05，说明由本试验数据所得的二次多项回归方程的拟合程度较好。综上，本试验具有统计学意义。A、B、C3个因素对试验中小桐子枝叶生物碱提取率的影响大小的顺序为A＞B＞C，并且得出二次项A2、B2、C2对响应值的影响比其他项更为显著，综上所述各因素与响应值之间并不是单一的线性关系。交互项对生物碱总含量影响的强弱可表示为BC＞AC＞AB，由此说明超声所用时间与所设温度比对响应值的影响明显。

表5 方差分析结果表

2.7.2 响应面分析

根据响应面图中评价此试验各个不同的因素之间的交互性强度，优选出最佳提取工艺。由图6可知，因素A（提取溶剂的体积分数）的曲面比其他两图较为陡峭，说明提取溶剂的体积分数的不同对生物碱成分提取效率的影响比其他两个因素大一些。BC交互作用强，说明超声所用时间与设置的温度的交互作用对生物碱总含量的影响比较明显，AB和AC交互作用是比较弱的，综上，溶剂的体积分数与超声所用的时间、设置的温度与超声所用的时间的交互作用对生物碱提取量的影响小一些。

图6 各因素与生物碱总提取量的响应面图

2.8 最优工艺与验证

通过本次试验得出最佳的提取方案为超声所用时间20.15 min，提取溶剂的体积分数为79.15%，超声温度为40 ℃。基于对试验本身实际操作情况的理解和后续试验的简便性的考虑，本试验最终确定的最优提取工艺为取样0.5 g的小桐子枝叶药材样品磨成粉末，加入79.15%乙醇，超声提取20.15 min，设置温度为40 ℃。分别选取3批小桐子叶药材饮片，在综上所述的最优工艺条件下做验证试验。试验所得生物碱成分总含量分别为0.606 0%、0.595 8%、0.601 4%，平均值为0.601 1%（RSD=0.85%），与模型中预测值的相对误差为0.59%，表明试验所建立的模拟回归方程拟合度高，经试验所得出的优化方案是稳定的、可靠的。

3 结论

有学者研究表明生物碱是以盐的形态存在于植物中的含氮有机化合物，其治病功效强，如毛莨科黄连根茎中的小蘖碱具有消炎作用，罂粟果皮中所含的吗啡碱可镇痛，三尖杉碱和长春花碱是治癌的良药。生物碱具有良好的应用前景，如何更加高效地从相关植物种提取出生物碱是当前生物用药方面必要的研究内容。

本试验采用超声法将小桐子枝叶药材中生物碱提取出来，相比于传统的酸（碱）性水溶液提取法、树脂吸附法、浸渍法用时更短，能耗更小，提取率增加且有效成分保留完整。在后续操作中，本试验利用单因素试验法结合Box－Behnken响应面法[8]，对各个单因素试验水平连续分析，从不同单因素中筛选出最适合小桐子枝叶生物碱提取条件，避免了因提取方案不佳造成的生物碱提取损失问题发生。本试验得到的小桐子枝叶中生物碱的最优提取工艺，操作简便、效率高、稳定可靠。