不同配方山苍子精油溶液剂的抑菌效果评价

王 彬，文 琳，刘诗羽，赵红琼，郝智慧*

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐 830052；2.中国农业大学动物医学院，中兽医药创新中心，北京海淀 100193)

随着集约化养殖的迅速发展，动物疾病严重威胁着畜牧养殖业的安全。数据表明，我国细菌性疫病高达111种，占动物传染病种类的50%以上[1-2]，给畜牧生产造成了巨大的损失。且随着我国“禁抗令”的全面推行，中草药和天然药物成为当今的研究重点。据Wikins等[3]报道，世界上有1389种植物有成为抑菌剂的可能，且研究表明植物精油具有广谱高效的抗菌活性[4-5]。目前有大量关于植物精油抑菌的研究，都证明了植物精油对细菌或霉菌有一定的抑制效果[6-7]，其中研究表明山苍子精油具有多种生物活性，可以抑制多种致病菌[8-9]，但尚未有单独使用山苍子精油为主要成分的溶液剂抑菌的研究。

本试验通过测定山苍子精油中主要活性成分的含量、山苍子精油原油的抑菌效果、以及辅料的筛选，制备出6种不同配方的山苍子精油的溶液剂。并且通过检测上述溶液剂对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和白色念珠菌的最小抑菌浓度(MIC)来比较不同山苍子精油溶液剂的抑菌效果，为山苍子精油溶液剂在细菌病的防治和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)，大肠埃希氏菌(8099)，白色念珠菌(ATCC 10231)，中国工业微生物菌种保藏中心提供。

1.1.2 主要试剂 MH肉汤培养基，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司产品；大豆酪蛋白琼脂(TSA)培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司产品；营养琼脂培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司产品；LB肉汤培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司产品；丙三醇，丙二醇，无水乙醇，吐温-80，国药集团化学试剂有限公司产品；山苍子精油，青岛植物当家生物科技有限公司产品；柠檬醛标准品，AccuStandard公司产品。

1.1.3 主要仪器 超净工作台(SW-CJ-2FD)，苏州净化设备有限公司产品；恒温生化培养箱(LRH-250F)，恒温生化摇床(HZQ-X300C)，上海一恒科学仪器有限公司产品；高压蒸汽灭菌锅(Gi80DS)，ZEALWAY公司产品；电子天平(ME203)，梅特勒-托利多集团产品；麦氏浊度仪(WGZ-2XJB)，上海昕瑞仪器仪表有限公司产品；烘箱，上海精宏实验设备有限公司产品；牛津杯，福建艾杰尔进出口有限公司产品；游标卡尺(NR0158)，锐能公司产品；气质联用仪(exactive GC orbitrap)，Thermo Fisher科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 气质联用仪检测山苍子精油主要成分含量 将山苍子精油原油通过气质联用仪测定其组分含量。根据GB 1886.35-2015方法进行检测，检测条件如下：

固定相：聚乙二醇。膜厚：0.25 μm。色谱炉温度：线性程序升温从70℃～250℃，速度2℃/min。进样口温度：250℃。检测器温度：250℃。检测器：氢火焰离子化检测器。载气：氮气。载气流速：1 mL/min。进样量：约0.3 μL。分流比：100∶1。

质谱仪条件参数：传输管温度250℃，扫描范围50～500Da。

1.2.2 体外抑菌试验 在无菌条件下，取生长至3代～18代的菌株平板，取典型单菌落，用灭菌的PBS溶液稀释成含菌(1×105～5×105)CFU/mL的菌悬液，取150 μL菌悬液涂布于平板培养基。取1只灭菌的牛津杯放于涂好菌液的平板培养基上，在牛津杯中加入150 μL的山苍子精油，盖好皿盖。金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌用营养琼脂平板培养基置于37℃恒温培养箱培养，白色念珠菌用TSA平板培养基置于25℃恒温培养箱培养，培养48 h后测量抑菌圈大小。每组试验重复3次。

抑菌圈判定的标准为[10]：抑菌圈直径>20 mm为极敏感，15 mm～20 mm为高度敏感，10 mm～14 mm为中度敏感，7 mm～9 mm为低度敏感，<7 mm为无抑菌作用或者不敏感，抑菌圈直径与抗菌活性成正比。

1.2.3 溶剂筛选试验 选取几种常用的辅料助剂，将山苍子精油与单个辅料助剂等比混合，静置后，观察山苍子精油在辅料中的溶解度。筛选出山苍子精油溶解度好且溶液剂稳定的辅料助剂。

1.2.4 山苍子精油溶液的制备 根据筛选出的辅料助剂，按照表1中的配方，将山苍子精油配制成不同浓度的山苍子精油溶液剂。

表1 6种山苍子精油溶液剂的不同配方表

1.2.5 溶液剂最小抑菌浓度检测 在无菌环境下，取长有第3代～第14代菌株[11]的平板，挑取具有典型特征的单菌落于无菌的MH肉汤中制得约含1×106CFU/mL的菌液备用。取U型底的96孔培养板，第1列加入配制好的山苍子精油溶液剂200 μL，其余各孔加入无菌MH肉汤100 μL，按照倍比稀释的方法稀释山苍子精油溶液剂，混匀后加入备用的菌液，使培养板中菌液的最终浓度保持为5×105CFU/mL。同时设立细菌阳性对照组和阴性对照组。将96孔培养板置于温度适宜的恒温培养箱中培养16 h～24 h后，读取结果并做好记录[12]。试验重复3次。

2 结果

2.1 山苍子精油主要成分的检测结果

山苍子精油GC-MS的色谱谱图如图1所示。经GC-MS检测分析及点对点法计算，本次使用的山苍子精油中柠檬醛的含量为19.87μg/mL。

2.2 山苍子精油的体外抑菌试验结果

根据十字交叉法测定山苍子精油原油对金黄色葡萄球菌ATCC 6538、大肠埃希氏菌8099和白色念珠菌ATCC 10231的抑制效果如表2所示。山苍子精油对金黄色葡萄球菌ATCC 6538的3次试验结果分别为27.5 mm、29.0 mm、24.0 mm；对大肠埃希氏菌8099的3次试验结果分别为21.0 mm、23.5 mm、21.0 mm；对白色念珠菌ATCC 10231的3次试验结果分别为27.0 mm、24.0 mm、25.5 mm，试验结果表明其抑菌圈直径均 > 20 mm，表示此3种菌株对山苍子精油的抑制极为敏感。且从表2中可以看出，本试验中的山苍子精油对金黄色葡萄球菌ATCC 6538和白色念珠菌ATCC 10231的抑制效果优于大肠埃希氏菌8099。

注：A.柠檬醛标准品的图谱，B.山苍子精油的图谱Note:A.The chromatogram of citral standard,B.The chromatogram of Litsea cubeba essential oil

表2 山苍子精油的抑菌试验结果

2.3 溶剂筛选结果

从表3中可以看出，山苍子精油不溶于丙三醇，其与丙三醇混合静置后会出现分层现象。山苍子精油分别加入至丙二醇、吐温-80和无水乙醇中混匀静置后得到一种稳定的溶液，且保存一定时间后未出现沉淀和分层现象，表示山苍子精油可以溶于上述溶剂。通过上述结果可以看出，山苍子精油不溶于丙三醇，但是可以溶于丙二醇、吐温-80和无水乙醇。

表3 山苍子精油的溶解情况

2.4 不同山苍子精油溶液剂对金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)的MIC的测定结果

分别用6种不同配方的山苍子精油溶液剂对金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)进行最小抑菌浓度检测，结果如表4所示。其中溶液剂A、溶液剂D和

溶液剂F的抑菌效果最好，其MIC值均为1.95 μL/mL。而溶液剂B和溶液剂C的抑菌效果最差，其MIC值为125.00 μL/mL。溶液剂E的抑菌效果介于二者之间，其MIC值为62.50 μL/mL。

表4 不同山苍子精油溶液剂对金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)的MIC结果

2.5 不同山苍子精油溶液剂对大肠埃希氏菌(8099)的MIC的测定结果

分别用6种不同配方的山苍子精油溶液剂对大肠埃希氏菌(8099)进行最小抑菌浓度检测，结果如表5所示。其中溶液剂B和溶液剂C对大肠埃希氏菌的抑制效果最好，其MIC值均为125.00 μL/mL。而溶液剂D对大肠埃希氏菌的抑制效果最差，其MIC值为500.00 μL/mL。溶液剂A、溶液剂E和溶液剂F的抑菌效果相同，且MIC值介于上述二者之间，其MIC值均为250.00 μL/mL。

表5 不同山苍子精油溶液剂对大肠埃希氏菌(8099)的MIC结果

2.6 不同山苍子精油溶液剂对白色念珠菌(ATCC 10231)的MIC的测定结果

分别用6种不同配方的山苍子精油溶液剂对白色念珠菌(ATCC 10231)进行最小抑菌浓度检测，结果如表6所示。结果显示，在3次重复试验中，6种不同配方的山苍子精油溶液剂对白色念珠菌(ATCC 10231)均未表现出抑制菌株生长的效果。

表6 不同山苍子精油溶液剂对白色念珠菌(ATCC 10231)的MIC结果

2.7 不同山苍子精油溶液剂的MIC结果对比

如图2所示，6种山苍子精油溶液对白色念珠菌(ATCC 10231)均无抑制效果，但对金黄色葡萄球菌的抑制效果均高于对大肠埃希氏菌的抑制效果。溶液剂A和溶液剂F对3种菌株的抑菌效果相同，均显示出其对金黄色葡萄球菌的抑制效果明显优于大肠杆菌，二者之间相差大约为128倍。溶液剂B和溶液剂C对3种菌株的抑制效果相同，其对金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的MIC均为125.00 μL/mL。溶液剂D对此3种菌株的抑菌效果差异最大，此溶液剂对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好(MIC1.95 μL/mL)，对大肠埃希氏菌的抑制效果最差(MIC为500.00 μL/mL)，二者之间相差大约为256倍。溶液剂E对3种菌株的抑制效果存在差异，对金黄色葡萄球菌的MIC为62.50 μL/mL，对大肠埃希氏菌的MIC为250.00 μL/mL，二者之间抑菌浓度相差4倍。

图2 不同山苍子精油溶液剂的MIC值

3 讨论

山苍子精油是天然植物精油具有防腐保鲜、趋避害虫等多种活性，且大量研究表明山苍子精油具有很好的抗菌作用[13-14]，然而目前还未有以山苍子精油为单独有效成分的溶液剂抗菌研究。本试验中首先检验了山苍子精油中主要成分柠檬醛的含量，并验证了山苍子精油的抑菌效果。然后进行了辅料的筛选，并制备了6种不同配方的山苍子精油溶液剂，并且通过测定上述溶液剂的最低抑菌浓度(MIC)评价了山苍子精油溶液剂对金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、大肠埃希氏菌(8099)和白色念珠菌(ATCC 10231)的抑菌效果。

表2中山苍子精油原液对3种菌株的抑菌圈直径均>20 mm，表现为菌株对山苍子精油的抑制极敏感，证明了山苍子精油对上述3种菌株具有很好的抑制效果。且可看出山苍子精油对金黄色葡萄球菌ATCC 6538和白色念珠菌ATCC 10231的抑制作用优于大肠埃希氏菌8099。

从图2和表4可看出在受试的6种不同配方的山苍子精油溶液剂中，抑菌效果最好的溶液剂A、溶液剂D和溶液剂F在达到最低抑菌浓度时所使用的山苍子精油的浓度低于王小丽等[15]应用纯山苍子精油进行最小抑菌浓度的精油浓度。故推测，本研究中选用的溶液剂的辅料增加了一定的抑制金黄色葡萄球菌的效果。而溶液剂B和溶液剂C对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最差，在溶液剂浓度为125.00 μL/mL时才能达到抑制细菌生长的效果，此结果结合表1可以推断出溶液剂中山苍子精油含量的多少影响了山苍子精油溶液剂对金黄色葡萄球菌的抑制效果。

6种山苍子精油溶液剂对大肠埃希氏菌的抑菌效果如图2和表5所示，抑菌效果最好的是溶液剂B和溶液剂C，其MIC均为125.00 μL/mL。但是在上述2种溶液剂达到最低抑菌浓度时所使用的山苍子精油的浓度高于吴均等[16]应用纯山苍子精油进行最小抑菌浓度的精油浓度，这可能是由于本文中使用的山苍子精油溶液剂中精油浓度较低，减弱了山苍子精油抑制大肠埃希氏菌的能力，或因溶液剂中辅料的配比没有达到最佳的比例而导致其对大肠埃希氏菌的抑制效果减弱，后续还应继续进行验证和研究。

根据图2和表6的结果，可以看出山苍子精油溶液剂对白色念珠菌无抑制效果，而根据表2的结果表明山苍子精油原油对白色念珠菌是有抑菌作用的，出现此结果的原因推测可能是因为山苍子精油中抑制白色念珠菌成分的含量变化引起的。研究表明，山苍子精油是通过抑制白色念珠菌初始阶段生物被膜的形成而达到抑制菌株生长的效果，但是其不能杀灭酵母细胞体[17]。因此推测，在将山苍子精油配制为山苍子精油溶液剂的过程中，对抑制白色念珠菌被膜的有效成分进行了稀释，达不到抑制浓度，故此山苍子精油溶液剂失去了抑制白色念珠菌的能力；或者是在配制山苍子精油溶液剂的过程中，山苍子精油中抑制白色念珠菌被膜的主要成分与溶液剂辅料发生反应而失去活性，故此山苍子精油溶液剂失去抑制白色念珠菌的能力。后续还应继续进行验证和研究。

综上所述可以得出结论，此6种山苍子精油溶液剂对革兰氏阳性菌的抑菌效果最好，对革兰氏阴性菌有一定的抑菌效果，但是没有对革兰氏阳性菌的抑菌效果好，且此6种山苍子精油溶液剂对真菌无抑菌效果。通过本试验的研究，为以山苍子精油为主要成分的溶液剂的抑菌效果研究提供了一定的数据支撑。