牛场辣椒的全基因组SNP标记分析

黄冬福， 何建文， 江叶莎， 付文婷， 范高领， 吴 迪， 詹永发, 石燕金， 王楠艺

(1.贵州省农业科学院辣椒研究所， 贵阳 550009； 2.遵义市农业农村局， 贵州 遵义 563000)

辣椒为茄科辣椒属植物，有极大的利用价值，营养价值高可鲜食，是一种重要的调味品，富含的辣椒碱具有一定的药用价值，辣椒红素可用于食品及化妆品的着色。贵州六枝特区的牛场辣椒于2014年被认定为国家地理标志产品，具有果色深红，肉厚，辣味适中，香气浓郁等优异品质[1]。辣椒基因组上含有多种分子标记。在众多的分子标记中，SNP(单核苷酸多态性)最重要且最具吸引力，其高水平的多态性、共显性、高通量、丰富的信息量[2]广泛用于作物育种中的遗传多样性分析、基因组关联分析及比较基因组学[3-6]。

国内外研究者获得了辣椒的大量SNP标记。Siddique等[7]对188个辣椒重组自交系个体和352个辣椒材料进行重测序，开发了666 405个SNP标记，结合经典的QTL定位和全基因组关联分析，获得了3个赋予疫病广谱抗性的主效QTL。Wu等[8]对287个辣椒材料进行重测序，获得了9 557 790个SNP，通过全基因组关联分析，发现调控26个辣椒农艺性状的2 126个候选基因。Wang等[9]对辣椒不育系和保持系的线粒体基因组测序，获得了两者间的112个SNP，结合已知的CMS(细胞质雄性不育)基因特征，筛选出2个最有可能决定CMS的ORF。Han等[10]对208份辣椒材料进行重测序，开发了109 610个SNP标记，发现99个SNP与辣椒素显著关联。孙茜[11]对辣椒抗感黄瓜花叶病毒(CMV)的基因池进行重测序，获得了51 969 152个SNP标记，结合关联分析和经典的QTL定位，发现了抗CMV的1个主效QTL和2个微效QTL。赵红[12]对349份国内辣椒核心种质进行重测序，平均每份种质获得了7 425 498个SNP，通过全基因组关联分析，发现94个SNP与果实辣味等20个性状显著关联。

就目前的研究来看，各研究者开发了大量辣椒SNP标记，但是所用品种没有涉及牛场辣椒，而利用已有的SNP标记重新筛选牛场辣椒特异的SNP费时费力且无法保证数量与质量。另外，各研究者开发SNP采用的是简化基因组测序法，基于此法开发的SNP无法覆盖全基因组，SNP的数量及密度远不如全基因组测序法。因此，本研究利用全基因组重测序分析牛场辣椒的SNP标记，为牛场辣椒遗传图谱构建、重要农艺性状基因挖掘、遗传改良、品种鉴定与保护奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

牛场辣椒(CapsicumannuumL.)，2014年被农业部认定为地理标志农产品，由贵州省辣椒研究所保存。取苗期的叶片用于全基因组重测序。

1.2 基因组DNA提取与DNA质量检测

采用DNA secure Plant Kit(TIANGEN)试剂盒提取基因组DNA；1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA是否降解和污染；NanoPhotometer®spectrophotometer (IMPLEN, CA, USA)检查 DNA 纯度；使用2.0 Flurometer (Life Technologies, CA, USA)检测DNA 浓度。

1.3 测序文库构建

分别取检测合格的DNA 样品700 ng，通过Covaris破碎机打断成长度为350 bp的片段，使用NEB Next®Ultra DNA Library Prep Kit(NEB, USA)构建文库，并将index codes添加到每个测序样本中。使用AMPure XP系统(Beckman Coulter，Beverly，USA)纯化DNA，DNA片段的3′末端腺苷酸化后，连接具有发夹环结构的NEB下游衔接子以准备杂交；PCR反应前使用电泳来选择指定长度的DNA片段，在USER酶(NEB，USA)的作用下，37 ℃ 15 min、95 ℃ 5 min；然后用Phusion High-Fidelity DNA聚合酶、Universal PCR引物和Index(X)引物进行PCR， PCR产物用AMPure XP系统进行纯化。文库构建完成后，先使用Qubit 2.0软件进行初步定量，稀释文库至1 ng/μL，随后使用Agilent Bioanalyzer 2100软件对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度>2 nmol/L)，保证文库质量。

1.4 全基因组测序和质量控制

利用Illumina HiSeq 2000平台进行全基因组测序，测序生成的原始图像数据文件经碱基识别转化为原始测序序列(Illumina pipeline CASAVA v 1.8.2)，然后通过质量控制去除以下不能用的reads，且两端reads均去除：

1) 带文库构建接头的reads；

2) 未知碱基超过10%的reads；

3) 低质量碱基(测序质量值≤5)超过50%的reads。

1.5 序列比对

质控后的有效测序数据经BWA软件比对到参考基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/10896，v1.0)，比对结果经SAMTOOLS和PICARD软件(http://picard.sourceforge.net)去除重复。

1.6 变异检测及注释

设定参数(-q 1-C 50-m 2-F 0.002-d 1000)，用samtools软件检测原始的SNP，然后用如下标准进行过滤：

1) 变异位置的测序深度>4；

2) 质量值>20。

用ANNOVAR软件对SNP进行变异注释。

2 结果与分析

2.1 测序数据产出及与参考基因组比对分析

由表1可知，经过全基因组重测序，共获得785 408 260条Raw reads，平均读长150 bp，碱基总长为117.8 Gb；通过质量控制去除带接头的reads、未知碱基超过10%的reads以及低质量(Q值≤5)碱基数超过50%的reads，得到高质量的clean reads；clean reads共有783 349 390条，覆盖98.23%的基因组；去除clean reads中的非特异reads，获得771 948 477条有效reads，其中758 748 158条reads能锚定到“遵辣1号”参考基因组上，配对率为98.29%，平均测序深度为36.35×。

表1 牛场辣椒测序数据产出及与参考基因组比对情况Table 1 The sequencing data of Niuchang pepper and the result compared with the reference genome

2.2 染色体上SNP的分布规律和特征

根据与参考基因组的比较，SNP分为纯合和杂合类型，分别占SNP总数的59.12%、40.88%。每条染色体上的SNP总数不同，10号染色体上SNP总数最多(1 371 387个)，4号染色体上SNP总数最少(349 894个)。每条染色体上纯合和杂合SNP的数量也不同， 10号染色体上的纯合SNP最多(889 193个)，9号染色体上的纯合SNP最少(169 010个)，9号染色体上的杂合SNP最多(779 326个)，4号染色体上的杂合SNP最少(93 614个)，具体见表2。

每条染色体上密度最高区域SNP出现频率不同，10号染色体上密度最高区域SNP出现频率最高(1 904个/100 kb)，4号染色体上密度最高区域SNP出现频率最低(1 162个/100 kb)，具体见表3和图1。

表2 每条染色体上SNP的数量Table 2 The number of SNP on each chromosome

表3 每条染色体上SNP密度最高区域及其出现频率Table 3 The frequency of SNP in highest SNP densityarea of chromosomes

2.3 基因组不同位置SNP分布特征

牛场辣椒基因组中的SNP分布在5个不同位置：基因上游、基因内、基因下游、基因上游/下游、基因间。(基因上游是指基因上游1 kb区域；基因内指基因内部；基因下游指基因下游1 kb区域；基因上游/下游指基因上游1 kb区域，同时也在另一基因的下游1 kb区域；基因间指两个基因间区)。5个不同位置的SNP数量不同且差异显著，SNP数量从多到少依次为基因间>基因内>基因上游>基因下游>基因上游/下游(表4)，基因间、基因内、基因上游、基因下游的SNP占比依次为94.68%、3.64%、0.9%、0.74%(图2)。

基因内不同位置所含SNP数量也不同，基因内包含外显子、内含子、剪接位点3个位置，所含SNP数量分别为51 242、281 002、288个，SNP数量从多到少依次为内含子、外显子、剪接位点。针对外显子区域，根据SNP变异引起的密码子变化， 可将SNP分为4种类型：终止子获得、终止子缺失、同义突变、非同义突变，数量分别为710、188、19 079和31 265，SNP数量依次为非同义突变>同义突变>终止子获得>终止子缺失。

图1 每条染色体上的SNP密度热图 Fig.1 The density heat map of SNP on each chromosome

图2 牛场辣椒基因组中不同位置的SNP数量差异Fig.2 The number difference of SNP on the different position in the genome of Niuchang pepper

表4 牛场辣椒基因组中SNP的位置及相应数量Table 4 The position and corresponding number of SNP in the genome of Niuchang pepper

2.4 SNP突变频谱

全基因组SNP突变可分为6类：T∶A>G∶C，T∶A>C∶G，T∶A>A∶T，C∶G>T∶A，C∶G>G∶C和C∶G>A∶T。以T∶A>C∶G为例，此种类型SNP突变包括T>C和A>G。由于测序数据既可比对到参考基因组的正链，也可比对到参考基因组的负链，当T>C类型突变出现在参考基因组正链上，A>G类型突变即在参考基因组负链的相同位置，所以将T>C和A>G划分成一类。C∶G>T∶A的数量最多(3 109 688个)，C∶G>G∶C的数量最少(474 542个)。T∶A>G∶C、T∶A>A∶T、C∶G>G∶C、C∶G>A∶T为颠换，总数为3 057 408个，T∶A>C∶G及C∶G>T∶A为转换，总数为6 094 214个，发生转换的数量是颠换的1.99倍(图3)。

图3 SNP突变频谱Fig.3 The mutation frequency and type of SNP

3 讨论与结论

3.1 基于WGRS技术开发辣椒SNP标记的高效性

辣椒全基因组序列的公布为其分子育种带来前所未有的机遇。想要开展辣椒分子育种，就必须对群体中所有个体进行基因分型。利用传统方法对辣椒进行基因分型费用高、耗时耗力，低水平的分子标记也是基因分型的重要挑战。基于新一代测序技术(NGS)的基因分型通量高、成本低、分子标记密度高。

全基因组重测序(WGRS)是新一代测序技术(NGS)的一种。利用WGRS技术开发分子标记具有标记密度大、有效标记多、准确率和特异性高、稳定性好的优势。本研究利用WGRS技术共鉴定出9 141 358个SNP，SNP的出现频率为1个/366 bp，其中51 242个SNP位于外显子。Ahn利用WGRS技术获得了6 840 889个辣椒SNP，其中39 955个SNP位于外显子[13]。

相比而言，利用简化基因组测序开发SNP标记的效率较低。Nimmakayala等[14]利用简化基因组测序仅获得66 960个辣椒SNP，SNP的出现频率为1个/40.7 kb，其中仅有2 521个SNP位于外显子。Nimmakayala等[15]采用简化基因组测序获得77 407个辣椒SNP，SNP的出现频率为1个/35.6 kb，其中26 697个SNP位于外显子。由此可见，利用WGRS获得的SNP标记数量、出现频率、外显子上的SNP数量远高于简化基因组重测序[14-15]。

功能标记是分子标记的一种，基于功能基因内的多态序列开发，与常规的分子标记相比，与表型的连锁程度更紧密[16]，外显子上的SNP最可能作为功能标记。因此，通过检测功能标记能更准确地预测表型，在加速育种进程的同时极大地提高了标记辅助选择的准确性。本研究获得的51 242个外显子SNP作为潜在的功能标记，将成为辣椒分子育种的有力武器。

3.2 牛场辣椒SNP标记分布特征

SNP在牛场辣椒基因组上的分布表明，基因间的SNP数量比基因内多，是基因内的26倍，内含子区域的SNP数量比外显子多，是外显子区域的5.5倍，这种分布规律与Kim等[17]的研究结果相似。外显子上，SNP引起的终止子获得有710处，终止子获得是指碱基突变导致终止密码子提前出现。其产生截短的蛋白质，从而使基因散失原来的功能，并进一步引发作物表型变异。因此，终止子获得对基因功能研究具有重要意义。AFS1基因发生5 bp缺失及G/A转换，翻译提前终止，导致水稻小穗异常，小穗上多出一个外稃状器官，內稃发生不同程度的退化[18]。GmSG基因发生A/G转换，翻译提前终止，导致大豆种皮颜色由黄色转变为黄/绿色[19]。SNFL1基因单内含子上最后一个碱基发生单核苷酸突变，翻译提前终止，导致水稻旗叶变短变窄[20]。OsCUL 3 a蛋白翻译提前终止，导致水稻flg 22、几丁质诱导的活性氧、发病相关基因的表达量明显增加，进而产生类病斑[21]。

本研究发现,牛场辣椒10号染色体上的SNP数量最多，且18.17%的纯合SNP位于该染色体上，4号染色体上的SNP数量最少，与Nimmakayala[15]的研究结果不同，Nimmakayala的研究显示辣椒3号染色体上SNP数量最多，9号染色体上SNP数量最少，与Ahn[13]的研究结果也不同，Ahn的研究显示辣椒品种PRH 11号染色体上SNP数量最多，8号染色体上SNP数量最少。造成不同染色体上SNP分布频率差异的原因可能是不同研究者使用的辣椒品种不同。

SNP引起的点突变可分为转换和颠换。现有研究表明，人类基因组CpG中的胞嘧啶C能自发脱氨基变成胸腺嘧啶T，导致C∶G>T∶A的转换比T∶A>C∶G的转换多，同时，转换比颠换更容易发生，且转换的SNP是颠换的2倍[22]。牛场辣椒C∶G>T∶A的转换比T∶A>C∶G的转换多，且转换的SNP数量明显高于颠换，是颠换的1.99倍，与前人的研究结果基本一致。

本研究对牛场辣椒进行全基因组重测序，获得了9 141 358个SNP，SNP的出现频率为1个/366 bp，展示出WGRS技术开发辣椒SNP标记的高效性；其中51 242个SNP位于外显子上，外显子上的SNP具有开发成功能标记的巨大潜力，功能标记与表型的连锁程度更紧密，能极大地提高标记辅助选择的准确性，是辣椒分子育种的有力武器；外显子上的SNP产生了710处终止子，终止子获得会产生截短的蛋白质，使基因散失原来的功能，并进一步引发作物表型变异，对基因功能研究具有重要意义。