罂粟籽灭活效果测定方法的建立

尤 佳， 文朝慧， 强晓婷， 朱建宁

(1.兰州海关技术中心， 兰州 730010；2.甘肃省药品监督管理局药品和医疗器械不良反应监测中心， 兰州 730070;3.甘肃省药品监督管理局审评认证中心， 兰州 730070)

我国对罂粟种植实行严格管制，除药用科研外，一律禁植。国家卫计生函[2013]113号文件[1]规定，罂粟种子不可作为香料和调味品使用。然而在西方很多国家，罂粟籽是传统调味品，欧美主要用于各种糕点，在印度，罂粟籽制成粉加入饮料中。甘肃农垦集团有限公司是我国药用罂粟的唯一种植、加工、调拨单位，该公司把灭活罂粟籽的消费群体对准国际市场，近十年来将大批次灭活罂粟籽出口印度、美国、加拿大、英国、德国、荷兰、罗马尼亚等国家，2018年达到出口巅峰，出口灭活罂粟籽6 614 t，共148批次，货值1 360.8万美元。2002年，海关总署办公厅联合质检总局发布《海关总署办公厅、国家质量监督检验检疫总局办公厅关于大麻籽、罂粟籽进出口应证问题的通知》[2]中强调对以贸易方式申报进出口的大麻籽(商品编码：12079999)和罂粟籽(商品编码：12079100)，海关应凭检验检疫机构注明的“已经检验检疫机构灭活处理”或“经检验鉴定发芽率为0%”的《入/出境货物通关单》办理进出口验放手续。检验检疫机构直接灭活处理的，注明“已经检验检疫机构灭活处理”，检验检疫机构做发芽试验的，注明“经检验鉴定发芽率为**%”(**按实际检验结果填写)。然而现有涉及发芽方法的标准只针对普通常规作物种子，发芽计数方法对罂粟籽等涉毒种子不适用，而且国内外暂无涉毒种子灭活效果鉴定方法的研究。基于此，本实验研究罂粟籽灭活效果测定及评价方法，为制定相关行业标准提供技术支撑。

图1 20 ℃培养第5天Fig.1 The 5th day of culture at 20 ℃

1 材料与方法

1.1 材 料

未灭活罂粟籽(PapaversomniferumL.)、灭活罂粟籽均由甘肃农垦集团有限公司提供，其中未灭活罂粟籽材料已在兰州新区公安局报备。

1.2 最适发芽条件筛选

选取均匀、饱满、一致的种子，每个处理4次重复， 每个重复100粒种子。用纸上发芽方法，选取TP发芽床，置于培养箱中且保持滤纸潮湿。设置3个恒温(A1：20 ℃、A2：25 ℃、A3：30 ℃)和2个变温(B1：15 ℃ 16 h/25 ℃ 8 h，20 ℃ 16 h/30 ℃ 8 h)处理。每天光照8 h，黑暗16 h。种子移入培养箱后第3天开始记录，每24 h记录一次，变温处理下每天高温条件下光照8 h，低温条件下黑暗16 h。在发芽期间每日对发芽的种子进行观察，记录发芽数量。待发芽试验结束后，观察记录正常种苗、不正常种苗、新鲜未发芽、死种子的数量。并参照农作物种子检验规程(GB/T 3543—1995)[3]、草种子检验规程(GB/T 2930.7—2017)[4]计算种子发芽率，根据种子在最适发芽条件下的发芽时间确定计数时间，以种子发芽率超过50%的天数为初次计数时间，以种子达到最大发芽率的天数为末次计数时间。发芽率(%)=( 发芽终期全部正常种苗数/供试种子数)×100%。

1.3 数据处理

采用SPSS 22.0软件对发芽率进行差异显著性统计分析，分析采用Duncan法，p<0.05，Excel软件作图。

2 结果与分析

2.1 罂粟籽最适发芽温度

发芽测定结果(表1)显示，罂粟籽在20 ℃条件下发芽率最高(图1)，达94%，随着温度升高，发芽率逐渐降低(图2)，到30 ℃时发芽率为0%(图3)，B1变温发芽率为86%(图4)，B2变温发芽率为10%(图5)，均低于20 ℃恒温条件下。因此，判定罂粟籽最适发芽温度为20 ℃。

表1 不同温度处理对罂粟籽发芽的影响Table 1 Effects of different temperature treatments on seed germination percentage of poppy seeds

2.2 罂粟籽发芽计数时间

根据罂粟籽发芽率计数规律，初次计数时间确定为第5天，末次计数时间确定为第7天。

2.3 罂粟籽灭活效果测定方法

根据罂粟籽的最适发芽温度(20 ℃)及初次和末次计数时间，建立了罂粟籽灭活效果测定方法：

1) 送验样品充分混合均匀，随机数取250粒种子，以感量为0.000 1 g的分析天平称重并记录数据，从样品袋中随机选取不同点，以刚称重数据10倍的重量称取4个重复。或者使用数粒仪，随机数10 000粒种子，以2 500粒为一个重复。

图2 25 ℃培养第5天Fig.2 The 5th day of culture at 25°C

图3 30 ℃培养第5天Fig.3 The 5th day of culture at 30 ℃

2) 将一层或多层发芽纸平铺在透明的发芽盒内，倒入适量无菌蒸馏水湿润发芽纸，发芽期间发芽床应始终保持湿润。将种子均匀撒在湿润的发芽床上，每粒种子间应保持适当的距离，以尽量减少相邻种子间的影响，盖上盒盖，贴上标签。

3) 发芽盒置于20 ℃恒温光照培养箱进行培养，每天给予8 h光照。期间要经常检查温度、水分和通气状况。如有感染的种子应取出冲洗，严重感染的应更换发芽床。

4) 培养第5天进行第一次鉴定计数，第7天进行末次鉴定计数。

5) 每粒种子或幼苗的鉴定都必须按照GB/T 3543.4附录A规定的标准进行。在计数过程中，发育良好幼苗应从发芽床中拣出，对可疑、损伤、畸形或不均衡的幼苗，观察至末次鉴定计数。严重腐烂的幼苗或种子应从发芽床中除去，并随时增加计数。

2.4 罂粟籽灭活效果评价

4个重复中没有种子正常发芽，所有种子为死种子，判定发芽率=0%，灭活效果合格；

4个重复中，≥1粒种子正常发芽，即判定发芽率≠0%，灭活效果不合格。

3 讨 论

3.1 灭活效果测定及评价标准

罂粟籽因其特殊性，国内外鲜见其检验方法的报道，现有相关种子品质检验方面的国家标准有农作物种子检验规程(GB/T 3543-1995)、草种子检验规程(GB/T 2930.7-2017)、林木种子检验规程(GB/T 2772-1999)[5]，但这三个国家标准仅涉及常规普通植物种子，适用范围不包括罂粟种子。尤其重要的一点，这三个国家标准对发芽率结果计算和表示中写道：“正常幼苗、不正常幼苗和未发芽种子百分率的总和必须为100%，平均百分率修约到最近似的整数，修约0.5进入最大值中。”这意味着当遇见小于0.5%的发芽率，结果会近似为0，这对于常规需要正常发芽的植物种子来说是合适的，但并不适合判定罂粟籽的灭活效果。原因有二：第一，罂粟籽种子非常小，长约1 mm，宽0.8 mm，千粒重仅为0.362 g，每批出口量至少为50 t。灭活罂粟籽和普通种子相反，发芽率为0，死种子为100%才算结果合格，按原有标准一个发芽试验需4次重复，每个重复以100粒计，每批罂粟籽样品只需要检测400粒样品即可，但是400粒罂粟种子样本极少，大约0.142 g，只用这400粒种子的发芽情况判断该批次罂粟籽灭活效率是否达标非常不准确。第二,在实验结果计算中遇到发芽率大于0.5%的数值,可按原标准近似为1%,但是实验中经常出现值大于0%小于0.5%的计数。例如发芽率为0.25%时，10 000粒种子(重量只有3.62 g)中就会有25粒正常发芽长成健康植株，当有10 t货物时，即使是0.25%的发芽率，能长成健康植株的种子大约为69 060 773粒。然而国内现有所有种子品质标准中因为未将灭活罂粟籽列入考虑，计算都会将0.25%近似为0%。因此涉毒类种子的灭活效果测定方法和评价标准不应该参照普通作物种子发芽方法，对于涉毒类种子测定灭活效果时，试验样品量要足够，当≥1粒种子正常发芽，即可判定发芽率≠0%，灭活效果不合格。

图4 15 ℃ 16 h，25 ℃ 8 h培养第5天Fig.4 The 5th day of culture at 15 ℃ for 16 hours and 25 ℃ for 8 hours

图5 20 ℃ 16 h，30 ℃ 8 h培养第5天Fig.5 The 5th day of culture at 20 ℃ for 16 hours and 30 ℃ for 8 hours

3.2 灭活方法

常见种子灭活方法有：高温蒸煮、化学试剂处理、60Co辐照、高能电子加速器辐照。灭活处理后的罂粟籽出口用于食品加工，需要考虑食用安全性，因此辐照处理是常用手段。但是辐照处理需反复操作才能保证灭活效果达标，人力财力消耗大，高温蒸煮后再烘干可以保证灭活效果达标，步骤稍微繁琐，但是成本低廉效果好。

3.3 种子生活力测定与发芽率测定比较

在一般情况下，种子活力测定和发芽率测定的结果差异不大，而且活力测定时间短，但是针对罂粟籽的灭活效果，本研究未采用生活力测定来判断罂粟籽的灭活效果是否达标，原因有二：第一，种子生活力是指种子发芽的潜在能力或胚具有的生命力，它反映的是种子发芽率和休眠种子百分率的总和。所以种子生活力测定能提供给种子使用者和生产者重要的质量信息，是种子发芽和出苗率、幼苗生长的潜势、植株抗逆能力和生产潜力的总和，是种子品质的重要指标。

一般情况下，高活力的种子在适宜的条件下一定能发芽，而且发芽快，出苗整齐，也一定有高的生活力，能发芽的种子都是具有生活力的种子。但有生活力的种子不一定能发芽。正常罂粟种子经高能电子加速器等机器辐照后，生活力并未完全丧失，但是做发芽实验时，辐照后的种子只冒出一点点胚芽就停止生长，最后按不正常幼苗来算结果。第二，种子生活力测定方法有氯化三苯四氮唑法(TTC法)[6]、溴麝香草酚蓝法(BTB法)[7]、红墨水染色法[8]、纸上荧光法[9-10]，这些方法通过种子染色情况来判断种子是否具有活力，但是罂粟籽非常小，染色后肉眼观察非常困难，需要借助体式显微镜下逐一判断，耗时长且易误判。因此，用发芽率来判断种子灭活效果是否达标是最直观和准确的。

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