渗湿降浊方对非酒精性脂肪性肝病大鼠脂代谢及AMPK/PPAR-α信号通路的影响

许 铮 ， 吴凡伟 , 牛 璇 , 卢晓鹏

(1.广州中医药大学 ， 广东 广州 510006 ； 2.深圳市宝安区中医院 ， 广东 深圳 518000)

非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除长期大量饮酒和其他明确的肝损伤因素所引起的，以甘油三酯为主的脂质在肝细胞中蓄积为病理改变的肝脏代谢性疾病[1]。流行病学调查表明，欧美地区 NAFLD 的发病率在20%以上，我国发病率已达15%[2-3]。约1/3的非酒精性单纯性脂肪肝患者会发展为非酒精性脂肪性肝炎，并导致肝病相关的疾病和死亡[4]。目前其发病机制不明，有研究显示，NAFLD是一种与胰岛素抵抗和遗传易感相关的代谢应激性肝损伤，肝内大量游离脂肪酸的累积，使脂蛋白合成与分泌障碍，导致肝细胞发生脂肪性变性，引起该病的发生[5-6]。因此，改善机体脂代谢功能是治疗NAFLD的关键。研究证实，中药在调节血脂、改善脂质代谢等方面具有良好前景，并成为临床治疗NAFLD的重要手段[7-9]。本试验采用高脂高糖饲料喂养大鼠建立NAFLD模型，并以渗湿降浊方进行干预，观察脂代谢情况并分析其作用机制，为渗湿降浊方的临床运用及进一步研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要药材与试剂 渗湿降浊方：苍术10 g、茯苓15 g、厚朴10 g、法半夏15 g、滑石15 g、通草10 g、柴胡15 g、枳实10 g、赤芍10 g、三七10 g、茜草10 g和楮实子30 g，均由深圳市宝安区中医院药房提供，用法用量：煎煮，每次加6倍量水，煎50 min，制备成浓度为0.6 g/mL煎液，备用。阳性对照药物易善复(YSF)，即多烯磷脂酰胆碱胶囊，购自赛诺菲(北京)制药有限公司(批号：H20059010)；血清AMPK、PPAR-α ELISA检测试剂盒(批号：JL45405、JL11365)，均购自江莱生物科技有限公司；兔抗大鼠AMPK单克隆抗体、兔抗大鼠PPAR-α 多克隆抗体(批号：ab215270、ab32047)，均购自英国Abcam公司；即用型高效免疫组化二抗试剂盒(批号：UNIV-IHC-0001)，购自优宁维生物技术公司。

1.2 主要仪器 酶标仪(型号：EONC，基因有限公司)；全自动生化分析仪(TBA-40FR，日本东芝公司)；H.E.染色仪(型号：ST5020，Leica公司)；脱水机(型号：Pathcentre，Thermo公司)；包埋机(型号：Histostar，Thermo公司)；石蜡切片机(型号：RM2245，Leica公司)；显微镜(型号：BX61，Olympus公司)。

1.3 实验动物 36只7～8周龄雄性SPF级SD大鼠，体重(250±20)g，购自南方医科大学实验动物中心(动物合格证编号：44002100019096)。动物室内环境温度(21±1)℃，湿度(50±15)%，12 h明暗交替。

1.4 方法

1.4.1 NAFLD大鼠模型的建立 采用高脂高糖饲料进行模型制备，配方：蔗糖20.0%、猪油15.0%、胆固醇1.2%、胆酸钠0.2%、酪蛋白10.0%、磷酸氢钙0.6%、石粉0.4%、预混料0.4%、基础饲料52.2%，由广东省医学实验动物中心配置，连续喂养4周。造模成功标准：肉眼可见肝叶锋利的边缘消失，表面包膜紧张，颜色变浅、整体发黄并可见斑点状花纹；触摸时其硬度如泥块，并有油性分泌物；光镜下可见干细胞呈弥漫性脂肪变性，且出现水肿，部分可见坏死。

1.4.2 分组与干预 将造模成功的SD大鼠随机分为模型组[灌服生理盐水10 mL/(kg·bw)]，渗湿降浊方高、中、低剂量组[渗湿降浊方灌胃10、5 g/(kg·bw)和2.5 g/(kg·bw)],西药组[多烯磷脂酰胆碱混悬液灌胃1.2 g/(kg·bw)],每组各6只；同批饲养健康SD大鼠6只为空白对照组(不造模，灌服生理盐水)；1次/d，连续4周，每组给药容量均为10 mL/(kg·bw)。

1.4.3 观察指标 (1)肝质量、肝指数检测：对大鼠干预4周后称重，麻醉后取肝组织，滤纸吸干肝组织上的体液后称重，记录肝质量，计算肝指数(肝指数=肝质量/体质量×100%)，比较各组肝质量及肝指数大小。(2)肝组织病理学变化(光镜观察)：取肝中叶做病理组织学检查，4%多聚甲醛固定，脱水、包埋后做石蜡切片，常规苏木精-伊红(H.E.)染色，光镜下观察各组肝脏组织学变化特点。(3)血脂指标检测：各组大鼠腹主动脉采血，3 000 r/min离心15 min，分离血清，全自动生化分析仪检测各组大鼠血清中总胆固醇(Total cholesterol,TC)、三酰甘油(Triacylglycerol,TG)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL)和低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)的含量。(4)血清中AMPK、PPAR-α含量的检测：各组大鼠血清按照ELISA试剂盒说明书检测AMPK、PPAR-α的含量。(5)免疫组化法检测肝组织中AMPK、PPAR-α蛋白表达变化：二甲苯和梯度酒精对组织切片进行脱蜡、水化，0.3%的过氧化氢室温孵育10 min去除过氧化物酶，加超级封闭液孵育5 min以减少非特异性染色，一抗AMPK稀释浓度为1∶100，PPAR-α为1∶250。二抗孵育参照试剂盒说明书进行操作。DAB显色，苏木精复染、脱水、透明、中性树胶封片。采用Image pro plus 6.0图像分析系统测量积分光密度(IOD)值。

2 结果

2.1 肝质量与肝指数比较 与空白对照组比较，模型组大鼠肝质量、肝指数极显著增高(P<0.01)；与模型组相比，渗湿降浊方高、中剂量组肝质量，渗湿降浊方高剂量组肝指数极显著降低(P<0.01)(表1)。

表1 各组大鼠肝质量与肝指数比较

2.2 肝脏病理学分析 H.E.染色可见：空白对照组大鼠肝小叶结构完整、清晰；中央静脉大，管壁薄，肝索呈放射状分布其周围且排列整齐，肝窦清晰可见；肝细胞呈多边形且大小较一致，核结构清晰可见，细胞内少有脂质沉积。模型组大鼠肝组织可见重度弥漫性、肝细胞大泡性脂肪变性，肝细胞肿胀，呈明显气球样变，部分小叶可见坏死灶，汇管区可见明显的炎性细胞浸润，并向小叶内延伸，部分样本有明显的炎性细胞浸润聚集。渗湿降浊方高、中、低剂量组和西药组大鼠肝组织也可见不同程度弥漫性肝细胞脂肪变，但其程度和炎症浸润较模型组呈不同程度减少，其中高剂量组改善程度最为明显(图1)。

图1 各组大鼠肝组织的病理改变(H.E.染色,200×)

2.3 血清中血脂含量比较 血脂含量检测结果显示，与空白对照组相比，模型组大鼠血清中TC、TG、LDL含量均极显著升高(P<0.01)，HDL含量极显著降低(P<0.01)。与模型组比较，渗湿降浊方高、中、低剂量组和西药组血清中TC、TG、LDL含量均极显著降低(P<0.01)，HDL含量极显著增高(P<0.01)，且呈现剂量依赖性。与西药组相比，渗湿降浊方高、中、低剂量组血清TG、LDL含量，渗湿降浊方高、中剂量组血清TC含量均明显降低(P<0.05或P<0.01)，渗湿降浊方低剂量组血清TC含量无明显变化(P>0.05)(表2)。

表2 渗湿降浊方对大鼠血清中TC、TG、HDL、LDL含量变化的影响

2.4 血清中AMPK、PPAR-α含量比较 与空白对照组相比，模型组血清AMPK、PPAR-α含量极显著降低(P<0.01)；与模型组相比，渗湿降浊方高、中、低剂量组和西药组AMPK含量，渗湿降浊方高、中剂量组和西药组PPAR-α含量极显著增高(P<0.01)，渗湿降浊方低剂量组血清PPAR-α含量无统计学意义(P>0.05)。与西药组相比，渗湿降浊方高、中、低剂量组血清AMPK含量和渗湿降浊方高、中剂量组PPAR-α含量极显著增高(P<0.01)，渗湿降浊方低剂量组血清PPAR-α含量无显著性差异(P>0.05)。提示渗湿降浊方能够显著提高非酒精性脂肪性肝病大鼠血清AMPK、PPAR-α的含量(表3)。

表3 渗湿降浊方对大鼠血清中AMPK、PPAR-α含量变化的影响

2.5 肝脏AMPK、PPAR-α蛋白表达比较 与空白对照组相比，模型组AMPK、PPAR-α蛋白表达极显著降低(P<0.01)；与模型组相比，渗湿降浊方高、中、低剂量组和西药组AMPK蛋白表达，渗湿降浊方高、中剂量组PPAR-α蛋白表达极显著增高(P<0.01)，渗湿降浊方低剂量组、西药组PPAR-α蛋白表达无统计学意义(P>0.05)。与西药组相比，渗湿降浊方高、中、低剂量组AMPK及渗湿降浊方高、中剂量组PPAR-α蛋白表达显著增高(P<0.01或P<0.05)，渗湿降浊方低剂量组PPAR-α蛋白表达无显著性差异(P>0.05)(表4)。

表4 渗湿降浊方对大鼠肝脏AMPK、PPAR-α表达水平的影响

3 讨论

尽管对NAFLD发病机制仍存在争议，但多数学者更认同“二次打击”学说[10-11]，认为非酒精性脂肪性肝病的发病与胰岛素抵抗密切相关，胰岛素抵抗是其发生发展的核心环节，脂质代谢异常是始动因子。机体通过何种方式调节肝脏脂肪细胞因子的表达水平，增强胰岛素与受体结合，提高胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗，降低脂质在肝脏的蓄积，成为目前研究的热点[12]。

渗湿降浊方为清末民初河南名医陈其昌的经验方，具有渗湿和里、活血化瘀、行气降浊之功效。前期临床研究表明，该方在治疗非酒精性脂肪性肝病方面具有一定疗效，具有改善肝功能、降低血脂的作用[13]。本试验成功建立非酒精性脂肪性肝病大鼠模型，经4周渗湿降浊方干预后，各渗湿降浊方组肝质量及肝指数较模型组显著降低，随着给药剂量的增加，肝组织细胞排列逐渐紧密，脂滴数亦相应减少，说明渗湿降浊方对NAFLD起到较好的治疗效果。另外，渗湿降浊方通过降低血清TC、TG和LDL含量及增高HDL含量发挥降脂作用。

AMPK作为细胞能量和氧化还原状态的传感器，是脂肪酸β氧化的关键酶，激活AMPK可增强脂肪分解而产生ATP，减弱同化作用以抑制消耗，可以抵抗氧化应激和增加脂肪酸利用率并抑制肝脏脂质合成[14-15]。同时AMPK通过磷酸化以增强下游线粒体的功能，提高能量代谢率，抑制脂肪合成，减少脂质沉积[16]。研究表明，AMPK通过改善胰岛素抵抗、调节NF-κB活性间接抑制肝脏炎症反应、促进脂联素高聚体的合成，提高葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性，从而减轻肝损伤、抑制NAFLD的发展[17-21]。本试验中，NAFLD大鼠AMPK表达量明显降低，而渗湿降浊方能有效提高其血清含量及肝脏组织蛋白表达，提示渗湿降浊方对NAFLD肝脏的保护作用可能是通过AMPK介导的信号通路实现。

PPAR-α是参与过氧化物酶体和线粒体β-氧化、脂肪酸转运和肝葡萄糖生成的转录调节因子，肝脏特异性敲除PPAR-α会破坏肝脏和全身脂肪酸的平衡及诱发NAFLD和高胆固醇血症[22]。上调PPAR-α能抑制促炎因子的生成和肝细胞炎症的发生，减轻肝纤维化[23]。本试验发现，渗湿降浊方干预可以诱导NAFLD大鼠PPAR-α蛋白表达增高，减少肝细胞脂肪病变。

综上所述，本试验初步证实渗湿降浊方对非酒精性脂肪性肝病大鼠具有一定的治疗作用，其作用机制可能与激活AMPK/PPAR-α信号通路，减轻内质网应激引起的炎症反应，加快脂质代谢有关。