腹泻驴驹粪源大肠杆菌的分离鉴定及毒力与耐药性分析

刘璐瑶，肖海侠，苟忻月，张毅，艾柯代·吐鲁洪，郑佳玉，程雪梅，郭庆勇，佟盼盼，苏战强

（新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

我国是传统养驴大国，随着驴役用地位的降低，新疆驴的存栏数已由2013年的90.3万头急剧下降到2018年的14.8万头，6年间存栏数量累计下降83.6%［1］。腹泻是引起驴驹死亡的常见病因之一［2］。0～6月龄驴驹腹泻发生现象较普遍，其中大肠杆菌是引起驴驹腹泻的主要致病菌之一，以体温升高、剧烈腹泻、脱水、严重时引发败血症为主要临床症状［3］，导致驴驹生长发育缓慢、生产性能降低，对养殖业造成严重的经济损失。

驴驹腹泻的发病率和病死率在不断升高，给驴驹疾病的临床治疗带来了极大困难［4］。2020年，新疆和田地区某规模化养驴场爆发了驴驹腹泻病，本试验旨在探究引起驴驹腹泻的病原及其临床耐药情况，从而为其生产管理和疾病防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料采集 2020年5月，无菌采集新疆和田某驴场腹泻驴驹的粪便样本，低温保存，及时进行细菌学分析。

1.1.2 主要试剂及仪器 主要试剂：脑心浸出液肉汤（brain heart infusion broth，BHI）、Mueller-Hinton琼脂（以下简称MH）、麦康凯培养基（以下简称MH），购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；细菌微量生化鉴定管，购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；药敏纸片，购自杭州滨和微生物试剂有限公司；PCR反应相关试剂（2×TaqPCR Green Mix、ddH2O），购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

主要仪器：自动高压灭菌器（HVE-50）、离心机（Eppendorf AG 22331 Hamburg）、振荡培养箱（ST-F160AC）、SW-CJ-2F双人超净台，购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；TProfessional PCR仪，购自Biometra公司；凝胶成像系统，购自UniversalHoodll BioRad公司。

1.1.3 试验动物 健康昆明系小白鼠，18～25 g/只，购自新疆医科大学医学动物中心。

1.2 试验方法

1.2.1 大肠杆菌的分离与培养 将腹泻样本接种于BHI培养基中，37℃恒温培养箱中培养18～24 h。使用接种环蘸取菌液接种于麦康凯培养基，于37℃恒温培养箱培养18～24 h，挑取不同形态、大小、颜色的单个菌落，革兰氏染色镜检；随后分别接种于麦康凯培养基和伊红美蓝培养基，37℃恒温培养箱培养18～24 h，革兰氏染色镜检。纯化3～4代后，使用50%甘油保菌，并置于-20℃保存备用。

1.2.2 16S rDNA鉴定 提取纯化后的菌株DNA，用16SrDNA引物进行扩增［5］（表1）。扩增产物于1%琼脂糖凝胶在1×TAE电泳液中电泳30 min，凝胶成像系统观察结果。PCR产物送至鼎国生物工程技术服务有限公司测序，所得序列在BLAST上进行同源性比对。

表1 引物序列

1.2.3 生化鉴定 将纯化后菌株接种于微量生化鉴定管中，于37℃恒温培养箱中培养18～24 h，参照《伯杰细菌鉴定手册》［5］进行结果比较。

1.2.4 药敏试验 选取24种常用临床抗菌药物，采用Kirby-Bauer纸片扩散法进行。用MH液体培养基稀释菌液到0.5麦氏浊度，用灭菌棉拭子蘸取菌液均匀涂布在MH培养基表面，静置3～5 min后用镊子夹取药敏片放置在培养基上，静置15 min后于37℃恒温培养箱倒置培养24 h。大肠杆菌ATCC 25922作质控菌株，药敏结果根据美国临床实验室国家标准化委员会（NCCLS）制定的标准判定［6］。

1.2.5 耐药基因和毒力基因检测 根据相关报道［7-14］引物序列（表1），合成β-内酰胺类药物的耐 药 基 因（blaCTX-M、blaCTX-M-1、blaCTX-M-2、blaCTX-M-9、blaTEM和blaSHV）、四环素类药物的耐药基因（tetA、tetG和tetE）、氨基糖苷类药物的耐药基因（aac和aadA1）、磺胺类药物的耐药基因（sul1）和氯霉素类的耐药基因（cmlA）。根据参考文献［15-20］中报道的引物序列（表1），合成毒力基因astA、sepA、escV、hlyA、fyuA、ler、irp2、iucD和eaeA。PCR扩增体系（25μL）：2×TaqPCR Green Mix 12.5μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1 μL，ddH2O补至25μL。扩增后使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察结果。

1.2.6 致病性试验 将分离菌株接种于BHI培养基，37℃摇床培养18～24 h；用BHI将菌液稀释至1×108cfu/mL。取昆明小白鼠40只，每5只为一组，随机分为8组，禁食不禁水12 h后，试验组腹腔注射菌液0.3 mL/只（A～C组），对照组小鼠注射等量生理盐水，观察小鼠在72 h内精神状态、食欲、发病和死亡情况。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离与鉴定

将采集的3份腹泻驴驹的粪便样本接种于麦康凯培养基上，共筛选出3株菌，在平板上形态均为红色、中等大小、表面光滑、边缘整齐的桃红色菌落。镜检结果显示，分离菌均呈现单个、着色均匀以及紫红色两端钝圆、无芽孢、无荚膜短杆菌，为革兰氏阴性菌。经生化鉴定显示，硫化氢、苯丙氨酸与尿素为阴性，蛋白胨水（靛基质）呈阳性，均能发酵葡萄糖、赖氨酸、鸟氨酸、乳糖与卫矛醇，在西蒙氏枸橼酸盐上有个别菌株为阳性，所有生化反应完全符合大肠杆菌的特性。对所得菌株进行16SrDNA PCR检测，在1500 bp处出现清晰明亮的目的条带（图1），将测序结果进行BLAST同源性比对，结合分离菌株在平板生长特点以及生化鉴定结果，最终确定3株分离菌为大肠杆菌。

图1 16SrDNA PCR扩增图谱

2.2 药敏试验结果

药敏试验结果（表2）显示，3株大肠杆菌均对头孢噻吩、头孢唑林、氨苄西林、哌拉西林、苯唑西林、青霉素G、四环素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、复方新诺明、氯霉素和氟苯尼考表现出100%耐药，仅对头孢吡肟、头孢西丁表现为高度敏感。

表2 3株大肠杆菌药敏试验结果

对菌株的耐药组合进行归类，3株大肠杆菌分别对16、18、19种抗生素耐药（图2），提示此驴场的抗菌药物使用不规范，抗菌药物过度使用。

图2 大肠杆菌分离株对24种药物的耐药组合情况

2.3 耐药基因的PCR检测

对3株驴驹粪源大肠杆菌进行耐药基因检测，结果（图3）表明，13种耐药基因共检测出7种，分别为blaCTX-M-1（100%）、blaTEM（100%）、tetG（100%）、blaSHV（100%）、aadA1（66.7%）、sul1（66.7%）和cmlA（66.7%），未检测出blaCTX-M、blaCTX-M-2、blaCTX-M-9、tetA、tetE和aac基因。

图3 耐药基因扩增图谱

2.4 大肠杆菌毒力基因的PCR检测

由图4可知，9种毒力基因共检出fyuA（66.7%）、irp2（100%）、iucD（100%）3种，目的条带大小分别为953、413、714 bp；其他基因均未检测出。

图4 毒力基因扩增图谱

2.5 致病性试验结果

将纯化后的菌液分别腹腔注射小鼠后，试验组小鼠出现精神萎靡、扎堆、饮食欲下降、被毛粗乱、尿液颜色发黄等现象。A组和B组均死亡4只，C组死亡3只，对照组无小鼠死亡现象；对死亡小鼠进行剖检，可见胃肠道内充盈黄色脓性液体且肠壁变薄、部分肠管出现臌气、肝脏出血、脾脏边缘暗紫色。无菌采集死亡小鼠肝脏等病料，进行革兰氏染色镜检，形态颜色等与大肠杆菌一致，表明从腹泻驴驹粪便中分离的大肠杆菌均为致病性大肠杆菌。

3 讨论与结论

驴养殖业是中央发布的精准脱贫的新兴特色产业，由于自然环境和地域经济等状况的约束，发病率和死亡率逐年增长，其中驴驹腹泻病严重者可引起驴驹脱水死亡。引起驴驹腹泻的原因是多因素的。有研究者证明轮状病毒与霉菌均可引起此症状，同时消化不良也可能会引起驴驹腹泻［21］；由大肠杆菌导致的幼驹腹泻病死亡率为10%～20%［22］。

大肠杆菌是重要的条件致病菌，一般通过粪便的排出从而污染圈舍、饲料、水槽及饮水、运动场地，是驴养殖业的一个重大隐患［23］。有研究证实大肠杆菌可依靠其快速定殖能力迅速侵袭新生幼驹胃肠道系统，表现为持续性剧烈腹泻，严重者表现为出血性肠炎，长期腹泻易导致机体脱水、电解质紊乱及败血症［24］。本试验从分离出的3株大肠杆菌中共检出3种毒力基因，分别为fyuA（66.7%）、irp2（100%）、iucD（100%）基因，其中fyuA和irp2的检出率与黑龙江地区［25］的差异较大。iucD的检出率远高于山东地区［26］（57%），说明大肠杆菌携带的毒力因子分布可能存在地域性差异。小鼠攻毒试验表明，所有分离株均具有致病性，表明新疆部分地区驴源大肠杆菌的致病性较强。

大肠杆菌的耐药性随着人们对抗生素的过度使用呈线性增长，出现了多重耐药和交叉耐药的现象，使临床治疗效果越来越差［27］。新疆石河子、沙湾等地区［28］导致犊牛腹泻的大肠杆菌对头孢西丁、阿米卡星具有较高敏感性，本试验中分离株对头孢他啶、头孢吡肟、头孢西丁、米诺环素、妥布霉素和阿米卡星的敏感性较高，说明同一地区、不同动物的粪源大肠杆菌的耐药较一致。山西省某驴场大肠杆菌仅对青霉素G和多黏菌素B耐药［29］，本试验分离株对头孢噻吩、头孢唑林、氨苄西林、哌拉西林、苯唑西林、青霉素G、四环素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、复方新诺明、氯霉素和氟苯尼考共13种临床常用抗生素高度耐药，其中1株分离菌对19种抗生素耐药，说明该驴场大肠杆菌的耐药性极强，抗菌药物的不合理使用导致大肠杆菌选择性地对多种抗生素产生耐药性［30］。

通过对3株驴驹腹泻粪源大肠杆菌进行耐药基因检测，该驴场的耐药基因携带情况与耐药表型基本一致。3株大肠杆菌的β-内酰胺类药物基因（blaCTX-M-1、blaTEM、blaSHV）携 带 率 均 为100%，与在广西地区［31］的检出率一致。四环素类药物耐药基因tetG的检出率高达100%，与在江西地区［32］检测结果一致。氨基糖苷类药物基因（aadA1）、磺胺类药物基因（sul1）和氯霉素类基因（cmlA）的携带率为66.7%，河北地区［33］、贵州地区［34］和四川地区［32］的基因检出率高于本研究。由此推测，携带耐药基因可能会导致细菌耐药，临床上在对驴驹腹泻病进行治疗时，需严格控制抗菌药物使用，先进行药敏试验，选择敏感性较高的抗菌药物，合理用药，防止出现广谱耐药的“超级细菌”［35］。