张海涛,张亚光,毛媛,刘克武
(1.上海海洋大学食品学院,上海 201302;2.黑龙江省林业科学院牡丹江分院,黑龙江 牡丹江 157010)
东紫苏(elsholtziabodinieriVant.),别名小香薷、凤尾茶、野山茶等,属唇形科、香薷属[1],多产于我国云南、甘肃、贵州等地,是常见农产品和民俗中草药,可用于治疗外感风寒、头痛咽痛等[2-3]。有学者对东紫苏植株全草进行了化学成分研究,发现其包含黄酮、多酚等多种化合物,但其主要成分及含量有待进一步分析[3-5]。东紫苏挥发油因其特殊的化学组成,表现出良好抗菌和杀虫活性,但其抗氧化活性研究未见报道[6]。采用水蒸汽蒸馏法提取东紫苏挥发油,运用GC-MS技术分析其主要化学组成,并考察其抗氧化活性,为东紫苏的综合开发利用提供理论依据和实验支撑[7-9]。
东紫苏,购自云南建水;无水乙醇(AR),1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH, 1, 1-Diphenyl- 2-picrylhydrazyl),购自国药集团化学试剂有限公司。UV/V-16/18紫外可见分光光度计,青岛聚创环保集团有限公司;BS104S电子分析天平,Sartoriu(德国);DRT-TW型调温电热套,上海新苗医疗器械制造有限公司;HP7890-5975C气相色谱-质谱联用仪,Agilent (美国)。
取东紫苏植株粉碎,过筛后,称取500 g样品置于挥发油提取器中,加蒸馏水5000 mL,按水蒸气蒸馏法提取8 h,提取次数2次,收集、合并得黄色澄清油状物。称重后除以投料质量计算得油率[10-12]。
色谱及质谱条件参照相关文献[7,13-15]。
1.4.1 DPPH检测波长的确定。DPPH分子在溶液中可生成含氮自由基,呈紫色,与自由基清除剂反应可生成无色产物。试验中DPPH检测波长选择518 nm,所测物质抗氧化能力越强,则被检体系颜色越浅。
1.4.2 DPPH溶液的配制。用无水乙醇溶解0.394 g的DPPH于500 mL容量瓶中,定容,摇匀,即得浓度为2 mmol/L的DPPH储备液,4 ℃冷藏备用。实验前用无水乙醇稀释10倍至0.2 mmol/L。
1.4.3 挥发油稀释液的配制。取适量挥发油,加无水乙,制备7种稀释液,分别置于试管,摇匀,备用,浓度分别为1.8294、3.6588、5.4882、7.3176、9.147、18.294、45.735 mg/mL。另设置不添加东紫苏挥发油的无水乙醇液为对照组。
1.4.4 东紫苏挥发油清除DPPH自由基的剂量效应。将稀释液分别与等体积DPPH储备液混匀,静置,待体系稳定(1 h),使用紫外可见分光光度计测定吸光值。实验平行3次,记录数值并按如下公式计算,AS为样品在518 nm波长下测定的吸光度值,A0为对照组。
DPPH自由基清除率(%)=(1-As/AO)×100
1.4.5 半抑制浓度(IC50)的计算。过不同浓度的东紫苏挥发油乙醇溶液对 DPPH自由基清除率进行线性拟合,计算其 IC50值(清除率为50%时的浓度值),以此评测其抗氧化能力[10]。
实验采用水蒸气蒸馏法共收集得到黄色澄清油状物1.281 g,并具有浓郁特殊香气,挥发油密度为0.9147 g/mL,得油率为2.56‰。采用GC-MS分析并核对,确定了其中含16个成分,占挥发油总质量的80.31%。如表1所示,桉树醇的相对含量为43.57%,占比最高。该成分分析结果与相关研究结果有所不同,可能是由于东紫苏的原产地不同所致[4-5]。
表1 东紫苏挥发油化学成分的GC-MS分析
为观察待测样品与清除率的时间变化规律,了解其反应动力学特性,实验选用0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液,加入18.294 mg/mL挥发油检测液后,发现反应平稳时间为60 min (图1)。当与相同体积不同浓度的挥发油稀释液混合时,体系的特征吸收峰在518 nm处明显降低,显示出对DPPH自由基的清除能力。对各浓度进行试验表明,各个样品在1 h后达到平稳,该时间点是稳定的检测点,进而可进行后续剂量效应实验。
图1 东紫苏挥发油对自由基清除率的时间变化曲线
根据以上选择的波长和反应时间,测定一系列质量浓度的挥发油乙醇溶液对DPPH自由基的清除率,并计算IC50值。如图2结果所示,当挥发油浓度小于18.29 mg/mL时,对DPPH自由基的清除率呈剂量效应,当挥发油浓度大于45.74 mg/mL时,随着东紫苏挥发油浓度升高,DPPH自由基清除率趋于平衡。
图2 东紫苏挥发油对自由基清除率反应曲线(60min)
如图2所示,确定挥发油浓度范围为1.83~18.29 mg/mL,重复平行实验3次,记录数值并计算作图,得出线性拟合方程:y=3.0058x+13.181(R2=0.9990)。基于该方程,可计算出东紫苏挥发油清除DPPH自由基的IC50值为12.25 mg/mL,表明其具有良好抗氧化活性。
图3 东紫苏挥发油对DPPH自由基清除率的线性拟合曲线
本研究以东紫苏为原材料,提取其挥发油,旨在分析东紫苏挥发油中的主要化学成分并研究其抗氧化活性。实验采用水蒸气蒸馏法收集、合并得黄色澄清油状物,GC-MS法分析确定了东紫苏挥发油中16种成分,其中含有大量的单萜类及其衍生物成分,如具有抑菌、消炎、抗氧化作用的一萜醇桉树醇。进而基于挥发油的脂溶性特点,选用DPPH法检测挥发油的抗氧化特性。当挥发油在1.83~18.29 mg/mL的浓度范围内,DPPH自由基清除率与东紫苏挥发油浓度呈现良好的量效关系,同时也证实了东紫苏挥发油具有较强的抗氧化性。天然植物提取的抗氧化剂因其安全低毒性,更满足人们的需求,未来可逐步取代合成抗氧化剂而应用于食品工业中。东紫苏在我国分布范围广泛,药食兼用,本研究为东紫苏的进一步综合开发利用提供理论基础。