通窍益脑方对东莨菪碱痴呆模型小鼠学习记忆行为的影响

阿力努尔·艾麦尔 聂雨楠 阿娜古丽·马合木提 高莉

1.新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐 830011；2.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所 新疆维吾尔医方剂学重点实验室，新疆乌鲁木齐 830049

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是老年人中最常见的致死性神经退行性疾病[1-2]，通常表现为进行性记忆力下降，伴随或随后出现的其他认知功能障碍，如视觉空间异常、导航困难、执行问题和语言障碍等[3]。随着人口老龄化的加剧，其发病率呈增高趋势，因此AD 也成为不能忽视的公共卫生问题，给家庭和社会造成巨大的经济负担[4]。目前临床上治疗AD的药物主要有多奈哌齐、盐酸美金刚片等，而这些药物均是以改善症状为主，并不能延缓或终止疾病的进展[5]，故仍需探索预防及延缓其发病进程或改善症状的药物。

本研究所用的通窍益脑方是由薰衣草、水龙骨、余甘子、牛舌草等几味药材配伍而成。研究证实这些药材具有抗氧化[6-12]、预防心脑血管疾病、降血脂[9-10]、保肝[10]、抗细胞凋亡[11,13]等功效。本研究建立东莨菪碱模型，观察通窍益脑方对东莨菪碱模型小鼠学习记忆行为及对脑内乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）、乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）和乙酰胆碱转移酶（choline acetyltransferase，ChAT）含量的影响，探讨其对获得性短暂记忆障碍小鼠学习记忆行为的改善作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF 级雄性昆明小鼠50 只，体重（20±2）g，由新疆医科大学动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（新）2018-0002。小鼠分笼饲养，12 h/12 h 白天和黑夜循环照明，自由饮水和进食。饲养温度为21～25℃，湿度为40%～60%。本研究经新疆维吾尔医药研究所动物伦理委员会批准。

1.2 药品与试剂

通窍益脑方（新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所自制）；氢溴酸东莨菪碱（Sigma 公司，批号：P1736201）；ACh 测试盒（南京建成生物工程研究所，批号：20201 223）；AChE 试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20201224）；ChAT 酶联免疫吸附试验试剂盒（江莱生物，批号：JL20662）。

1.3 仪器

SQP 型电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司，称量范围：0.01～120 g）；YLS-3TB 型跳台记录仪（济南益延科技发展有限公司）；1510 型全波长酶标仪（Thermo Fester Scientific）；TL2010S 高通量组织研磨仪（SOP-EQ036）；SPX-150B-Z 恒温生化培养箱。

1.4 动物分组、给药与模型制备

采用随机数字表法将50 只小鼠分为空白对照组、东莨菪碱模型组、多奈哌齐组、通窍益脑方0.41 g/kg组、通窍益脑方0.82 g/kg 组，每组10 只。各组按剂量连续灌胃给药29 d，空白对照组与东莨菪碱模型组给予相同剂量的溶媒。除空白对照组外，其他各组行为学实验前30 min 腹腔注射2 mg/kg 东莨菪碱造模，空白对照组腹腔注射生理盐水[14-15]。

1.5 跳台试验

给药第27～28 天进行跳台试验。跳台实验分为两个阶段：训练期和测试期。训练期将小鼠放入箱内适应3 min，然后立即通以36 V、2 mA 交流电，小鼠在受到电击后回到平台，多数动物可能会多次下台受到电击再回到平台，这是小鼠学习找台逃避电击的过程。如此训练5 min 记录实验小鼠第一次跳下绝缘平台的时间，为下台潜伏期；小鼠跳下绝缘平台遭受电击的次数，即下台错误次数作为学习成绩。24 h 后重复测试，记录下台潜伏期和下台错误次数作为记忆成绩[16-17]。

1.6 ACh、ChAT 含量及AChE 活力测定

给药第29 天断头取脑，用生理盐水冲洗大脑皮层表面血液然后在冰袋上分离海马组织。根据试剂盒说明书对海马组织进行预处理并检测小鼠海马中的ACh、ChAT 含量及AChE 活力。

1.7 统计学方法

采用SPSS 26.0 软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差比较分析或t 检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组跳台试验结果比较

与空白对照组比较，在跳台试验的训练期和测试期，东莨菪碱模型组下台潜伏期缩短，下台错误次数增加，差异有统计学意义（P <0.05）；与东莨菪碱模型组比较，在跳台试验的训练期和测试期，通窍益脑方0.41 g/kg 组、通窍益脑方0.82 g/kg 组下台潜伏期延长，下台错误次数减少，差异有统计学意义（P <0.05）；在跳台试验的训练期和测试期，通窍益脑方0.41 g/kg 组与通窍益脑方0.82 g/kg 组下台潜伏期、下台错误次数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 各组跳台试验结果比较（n=10）

2.2 各组ACh、ChAT 含量及AChE 活力比较

与空白对照组比较，东莨菪碱模型组ACh、ChAT含量下降，AChE 活力升高，差异有统计学意义（P <0.05）；与东莨菪碱模型组比较，通窍益脑方0.41 g/kg组、通窍益脑方0.82 g/kg 组ACh、ChAT 含量升高，AChE 活力下降，差异有统计学意义（P <0.05）；通窍益脑方0.41 g/kg 组与通窍益脑方0.82 g/kg 组ACh、ChAT 含量，AChE 活力比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

图2 各组ACh、ChAT 含量及AChE 活力比较（n=10）

3 讨论

研究表明，胆碱能突触在人类中枢神经系统中无处不在[18]。他们在丘脑、纹状体、边缘系统和新皮质中的高密度表达表明胆碱能的传递可能对记忆、学习、注意力和其他高级大脑功能至关重要[19-20]，而中枢胆碱能系统功能损伤是导致AD 的重要发病机制[21]。ACh 是脑内重要的神经递质，突触前膜ACh 的合成、ChAT 酶活性、AChE 活性都与AD 患者学习记忆能力的损伤有关[22]。

AD 患者脑内ACh 含量普遍偏低，这可能是形成AD 的主要原因之一[23]。东莨菪碱是M 受体阻断药，特异性抑制大脑1 级记忆转变成2 级记忆的过程，干扰近期记忆的形成，从而模拟AD 胆碱能系统受损，一直被广泛用于AD 机制研究及药物开发[24]。因此，本研究使用腹腔注射东莨菪碱造模，抑制中枢胆碱能系统，神经元缺失后神经递质ACh 减少，造成学习记忆功能受损，此种造模方法对记忆影响的机制较为明确，重现性较好，因此广泛应用[25-26]。

本研究结果显示，与空白对照组比较，东莨菪碱模型组在跳台实验中下台潜伏期缩短，下台错误次数增加（P <0.05），提示造模成功，且造模过程中未出现小鼠死亡。本研究结果显示，与东莨菪碱模型组比较，通窍益脑方0.41 g/kg 组、通窍益脑方0.82 g/kg 组ACh、ChAT 含量升高，AChE 活力下降（P <0.05），提示通窍益脑方作用于脑内中枢胆碱能系统，但无法确定量效关系，因此还需要做进一步研究确定量效关系、作用机制以及病理变化。